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 技术文章
dharmacon CRISPR Guide RNA
点击次数:756 发布时间:2019-02-11

 

dharmacon CRISPR Guide RNA

CRISPR指南RNA

用于靶向基因敲除的慢病毒和合成试剂

指导RNAs程序Cas9核酸酶切割特定的基因组位置。设计有效的功能性指导RNA对于实现有效的基因敲除至关重要。

了解指导RNA产品的更多信息

  • 合成的crRNA

    预先设计或定制合成,用于跨越许多基因的快速敲除研究

  • 慢病毒sgRNA

    预先设计或定制的sgRNA作为甘油储备和高滴度纯化的慢病毒颗粒,用于小规模和大规模研究

  • 合成sgRNA

    用于CRISPR-Cas9基因编辑的定制单指导RNA寡核苷酸

 

  • 所有Edit-R预先设计的指导RNA(合成的crRNA和慢病毒sgRNA)都设计有经过验证的算法,以提高功能性敲除的可能性,而不仅仅是双链断裂(DSB)。通过评估数千种设计的功能表型,然后在其他测定系统中验证我们的设计规则,我们建立了确定更有可能提供特异性切割和功能性敲除的靶位点的规则。

    可以使用CRISPR设计工具为任何序列定制设计Edit-R合成sgRNA和crRNA 。

    CRISPR-Cas9系统中的指导RNA

    除了表达Cas9核酸酶之外,CRISPR-Cas9系统还需要特定的RNA部分来募集和指导核酸酶活性。这些指导RNA采用以下两种形式之一:

    • 长化学合成的反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)加上化学合成的CRISPR RNA(crRNA),用于切割感兴趣的基因靶位点(图1a
    • -要么-
    • 合成或表达的单一指导RNA(sgRNA),由crRNA和tracrRNA组成,作为单一构建体(图1b
    由crRNA编程的Cas9核酸酶的插图:tracr复合物切割PAM的5'基因组DNA的两条链

    图1a。由crRNA编程的Cas9核酸酶的插图:tracr复合物切割PAM的5'基因组DNA的两条链

    由sgRNA复合物编程的Cas9核酸酶的插图切割PAM的5'基因组DNA的两条链

    图1b。由sgRNA复合物编程的Cas9核酸酶的插图切割PAM的5'基因组DNA的两条链

 

 

RISPR指南RNA产品

合成指导RNA

  • Edit-R预先设计的crRNA

    保证编辑你的目标!算法优化的crRNA,用于人类,小鼠或大鼠基因的全基因组覆盖。核酸酶抗性的修饰改善了无DNA编辑。只需搜索您的基因!

  • Edit-R tracrRNA

    Edit-R反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)是合成的,HPLC纯化的长RNA,需要与Edit-R crRNA一起使用以形成编程Cas9核酸酶的复合物。它经过核酸酶抗性修饰,可与修饰或未修饰的Edit-R crRNA一起使用。

  • Edit-R合成sgRNA

    定制合成100-mer单指导RNA,输入您自己的设计或使用我们灵活的设计工具

  • Edit-R合成阳性crRNA控制和检测引物

    针对特征良好的基因的物种特异性crRNA,以及错配检测分析引物,以确定基因编辑条件对大效率的有效性。

  • Edit-R合成crRNA非靶向对照

    非靶向对照以在缺乏基因靶特异性crRNA的情况下评估对CRISPR-Cas9组分的细胞应答。

  • Edit-R crRNA文库

    用于阵列敲除筛选的流行基因家族的预定义集合

  • 樱桃挑选图书馆

    有一个喜欢的基因列表?定制并订购预先设计的crRNA板,用于您感兴趣的目标中的敲除研究

 

一体化慢病毒sgRNA产品

  • Edit-R一体化慢病毒sgRNA

    全基因组结合Cas9和sgRNA,实现有效的基因敲除和的特异性; 可用作甘油原料和高滴度纯化颗粒。

  • Edit-R一体化慢病毒sgRNA阳性对照和试剂盒

    控制一体化慢病毒sgRNA以验证DNA双链断裂和基因编辑效率。

  • Edit-R一体化慢病毒sgRNA非靶向对照

    生物信息学设计和验证的一体化慢病毒sgRNA构建体不靶向人,小鼠或大鼠基因组中的任何基因。

 

慢病毒指南RNA

  • Edit-R预先设计了慢病毒sgRNA

    保证编辑你的目标!算法优化的sgRNA,用于人类,小鼠或大鼠基因的全基因组覆盖。提供高滴度的慢病毒颗粒和甘油储备。

  • Edit-R慢病毒sgRNA阳性对照

    针对特征良好的基因的物种特异性sgRNA,以确定基因编辑条件对大效率的有效性。

  • Edit-R慢病毒sgRNA非靶向对照

    非靶向对照以在缺乏基因靶特异性sgRNA的情况下评估对CRISPR-Cas9组分的细胞应答

  • Edit-R汇集慢病毒sgRNA文库

    用于人和小鼠中预定基因集的高滴度合并筛选文库。

  • Edit-R阵列慢病毒sgRNA文库

    用于高通量敲除筛选的整个人类基因家族的慢病毒sgRNA文库的阵列集合。

 

定制指南RNA设计和订购工具

  • CRISPR设计工具

    放置自定义指南RNA订单,或使用我们易于使用的界面设计和订购您自己的合成sgRNA,crRNA或慢病毒sgRNA。

 

HDR捐赠者模板设计和订购工具

  • Edit-R HDR捐赠设计师 - 寡头

    设计并订购单链DNA供体(≤150nt)用于插入,缺失或其他改变。

  • Edit-R HDR Donor Designer - 质粒

    设计并订购用于插入mKate2或EGFP荧光标记物或定制插入物的质粒DNA供体试剂盒

 

HDR捐赠者模板成套工具

  • Edit-R HDR质粒供体试剂盒

    快速且容易地组装用于HDR的质粒供体

  • Edit-R HDR质粒供体组件

    快速有效地构建HDR供体质粒

  • Edit-R HDR质粒供体引物

    Edit-R质粒供体试剂盒的PCR组件

 

指南RNA选择指南

为实验确定合适的指导RNA类型取决于您的特定实验或细胞类型。查看此表中的功能,开始选择宜指导RNA试剂。

 合成的crRNA合成单指导RNA(sgRNA)慢病毒sgRNA质粒(甘油原液)慢病毒sgRNA颗粒
使用前将1:1与tracrRNA组合   
与Cas9 mRNA或蛋白质共电穿孔  
与Cas9 mRNA或蛋白质共转染 
创建稳定的细胞系
 
   
用抗性标记富集群体  
可用预先设计的功能敲除和特异性的验证算法 
可从CRISPR设计工具处获得 - 在线设计

 

 

所有Edit-R预先设计的指导RNA(合成的crRNA和慢病毒sgRNA)都设计有经过验证的算法,以提高功能性敲除的可能性,而不仅仅是双链断裂(DSB)。

单独的位置不是CRISPR靶位点功能的指示

单独的位置不是CRISPR靶位点功能的指示

沿着VCP基因的编码序列的长度评估crRNA的功能性表明没有特定的模式,因为它涉及外显子位置,增强了设计算法表征功能特征的重要性。重组U2OS Ubi [G76V] -EGFP -Cas9细胞用266种不同的合成crRNA:tracrRNA复合物转染,靶向VCP基因沿着基因编码区的长度(使用DharmaFECT 4 Transfection Reagent,0.07μg/孔和50 nM合成crRNA) :tracrRNA终浓度)。72小时后,使用Envision读板仪(Perkin Elmer)测量EGFP荧光。

具有来自Edit-R算法的高分数的crRNA具有比低评分设计更高的分裂效率

具有来自Edit-R算法的高分数的crRNA具有比低评分设计更高的分裂效率

对10个基因(蓝色条)具有高功能评分的10个crRNA和对相同基因(黄色条)具有低功能评分的10个crRNA通过下一代测序进行编辑测试。93%的高评分crRNA和32%的低评分crRNA显示> 40%的编辑(插入缺失)。用50nM crRNA:tracrRNA转染Cas9-HEK293T细胞系,使用0.25μL/孔的DharmaFECT 1.转染后72小时,裂解细胞并且每个处理的细胞产生跨越每个crRNA位点的Nextera转座子适应的扩增子。样品以及来自未转染样品的匹配对照扩增子。使用Nextera 96​​孔索引试剂盒对样品进行索引,并合并用于在MiSeq仪器上进行测序(成对的末端读数,2×300长度)。通过NGS质量过滤标准的读数与参考文件(Bowtie2 v2.1.0)对齐。计算完整读数的百分比并将其标准化为对照未转染的样品(Samtools v0.1.12a); 数据显示为已编辑的标准化百分比。

具有高算法的功能评分的crRNA在其他功能测定中也表现良好

高评分crRNA在ApoONE测定中表现出更强的表型

将具有整合的Cas9(在CAG启动子下)的U2OS-蛋白酶体细胞以每孔10,000个细胞接种在96孔板中。铺板后24小时,使用0.2μg/孔的DF4,用25nM crRNA:tracrRNA转染细胞。使用ApoONE均相测定法(Promega)在转染后48小时分析细胞的凋亡。显示了在ApoONE测定中靶向BCL2L1,PLK1或WEE1的crRNA功能的箱形图表示。为了产生箱形图,基于它们的功能评分将crRNA分成下半部分(H1)和上半部分(H2)。中位数,下四分位数和上四分位数之间的数据分布以及小值和大值表明高得分的crRNA具有增加的功能。

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