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 技术文章
用于树突和树突棘浸染的GOLGT-COX染色系统-上海起发
点击次数:48 发布时间:2019-06-24

用于树突和树突棘浸染的GOLGT-COX染色系统-上海起发

                            仅限于体外研究

 

    Bioenno Golgi Kit是一种基于高尔基染色法设计出来的试剂盒,用于浸染神经元树突和树突棘(参见下面的参考文献)。该试剂盒在大鼠小鼠兔和猴子以及人类死亡后获得的新鲜脑组织上进行了广泛多次的测试,确定了该试剂盒能将树突和树突棘稳定和高质量的染色(见图A-C)。大多数神经元根据组织年龄大小用该试剂盒浸渍需要7-14天(见表2)。试剂盒储存室温(4-25ºC)下的黑暗区域。

 

图中为用Bioenno Golgi Kit侵染的树突分支和树突棘

(A):低倍率(4×物镜)显微镜照,显示海马体中高尔基体浸渍的神经元。

(B):从尾状后肌取出的纹状体神经元。左侧面板框架区域中的树突棘(20×)右侧图片中放大显示(箭头,63×)。

(C):从皮质采取的锥体神经元。 中间面板框架区中树突分支上的树突棘(20×)被放大显示 斜(左,100×)和 主(右,100×)。 这个阶段常观察到类似丝状伪足的突起(左侧图片的箭头)。

 

参考文献:

• Ramón-Moliner E: The Golgi-Cox technique. In Nauta WJH and Ebbesson SOE (eds.), Contemporary Methods in Neuroanatomy. pp 32–55, New York: Springer, 1970.

• Glaser ME and Van der Loos H: Analysis of thick brain sections by obverse-reverse computer microscopy: application of a new,high clarity Golgi-Nissl stain. J Neurosci Methods 1981, 4:117–125.

• Kolb B, Ladowski R, Gibb R, Gorny G. Does dendritic growth underlie recovery from neonatal occipital lesions in rats? Behav Brain Res 1996, 77:125–133.

• Gibb R and Kolb B. A method for vibratome sectioning of Golgi-Cox stained whole rat brain. J Neurosci Methods 1998, 79:1–4.

 

保质期:套件中的物品保质期为自购买之日起的12个月之内。

退货政策:Bioenno Tech对此产品的退货政策是自购买之日起90天之内。

 

随套件提供的材料

•溶液A:浸渍溶液(240 ml×2瓶)。溶液A是工作液,在底部看到沉淀物是正常现象,实验只需使用其上清液。

•试剂B:用于制备两种工作缓冲液。

缓冲液1:浸渍后缓冲液(30 g×5 瓶)制备方法:在90 ml dH2O中稀释 30g 试剂B

缓冲液2:收集和安装缓冲液(30 g×5 瓶)制备方法:在500 ml dH2O中稀释30 g试剂B

工作缓冲液可在4ºC下储存长达4周。

 

•溶液C:染色溶液(220 ml×2 瓶)。所提供的溶液C在使用前用dH2O(体积比为3:5)稀释。

例如,18ml溶液C + 30ml dH2O→48ml工作液,试剂盒中提供染色罐可刚好装下所制备的48ml工作液。 48ml工作液可用于多达120个切片(例如,在所提供的染色罐中总共有10个载玻片,每个载玻片黏附有12个鼠脑切片)。

 

•试剂D:复染缓冲液(90 g×2 瓶)。使用前需用dH2O稀释试剂。

在500 ml dH2O中稀释90 g试剂D形成工作液。工作液可在室温下储存长达3个月。

48ml工作液可用于多达120个切片(例如,如上所述在染色罐中的12个切片×10个载玻片)。

 

•还包含:

着色笔(大,尖端扁平,1 只),用于切片转移;

圆头笔(小,1 个),用于切片安装;

带盖的染色罐(2个),用于存储,染色和清洗粘连在粘性显微镜载玻片上的切片。

 

套件不提供的必要材料:

蒸馏水或去离子水(dH2O);

0.01M PBS-T(见表1);

塑料或玻璃管和瓶子;

塑料钳;

组织学用品和设备:粘合剂,显微镜载玻片,盖玻片,光学显微镜,震动切片机或微切片机,乙醇,二甲苯或二甲苯替代品,Permount®封片剂。

 

 

 

0.01 M PBS-T, pH 7.4

 

1000ml

NaCl

 

0.1 M PB (pH 7.4)

 

Triton X-100

 

加入 dH2O 至

 

加热搅拌至50~55℃,以增强 Triton X-100的溶解

8.5g

 

100ml

 

3ml

 

1000ml

表1:制备0.01M PBS-T,需先配制0.1M PB(左),然后配制含有0.3%Triton X-100的PBS(右)。

 

0.1M PB, PH7.4

 

1000ml

NaH2PO4 •dH2O

 

NaH2PO4 •7dH2O

 

加入 dH2O 至

 

(搅拌使其溶解)

2.62g

 

21.73g

 

1000ml

 

 

存储、安全和处理注意事项:

·•将试剂盒存放在室温下。

·•试剂盒中的溶液A和C为含剧毒试剂。 需在通风橱中准备并使用,使用完后收集所有废物。

  套件A中含有用于危险废物处理的瓶子。

·•在处理试剂盒试剂时,需戴上手套,眼睛和面部有适当的防护以及穿戴合适的防护服,处理后需彻底清洗双手。

·•处理时避免试剂的吸入和接触皮肤,眼睛。 如接触,立即用水彻底清洗,必要时寻求医疗援助。

 

 

建议

·•在处理溶液A和C时使用带盖的玻璃或塑料容器。

·•始终保持容器密闭。不要使用金属工具来承装溶液A。

·•使用溶液A,C或D处理大脑或切片时,避免大脑或切片受光照影响。

·•不要重复使用或稀释工作液,在室温下进行实验以获得最宜效果。

 

 

1.浸渍:将刚收获的脑组织浸入溶液A中。溶液A的体积大约是组织块体积的10倍。 例如, 20ml溶液A对应成年大鼠脑(1cm×1cm×2cm)体积。

浸泡1~2天后更换溶液,并在室温下继续避光浸渍(建议浸渍天数见表2)。

意见建议:为了获得最宜侵染,建议用生理盐水灌注动物,清除组织中的血液。 麻醉动物(例如用戊巴匕匕妥钠,腹膜内注射100mg / kg)。心脏内或升主动脉用0.9%生理盐水(例如 1000ml dH2O中含有9g NaCl)灌注至内脏血液量被冲洗掉。灌注通常需要3~5分钟。 解剖大脑并将其谨慎地从头骨上移除。用锋利的刀片切割大脑至1厘米左右的厚度,在0.9%盐水中短暂冲洗,然后浸入溶液A.

 

表2:20-22℃下建议的浸渍总天数(P:出生后一天; 如:P2表示“2天龄”)

动物年龄

尺寸

浸渍时间

P2大鼠

全脑包括头骨无灌注

无灌注,9天

P6大鼠

半球

盐水灌注,7天

P10大鼠

半球

盐水灌注,9天

P24大鼠

半球

盐水灌注,10天

P24大鼠

海马块包括皮质

盐水灌注,10天

3-4月大鼠

海马块包括皮质

盐水灌注,11天

P6小鼠

全脑

无灌注,8天   盐水灌注,7天

2-3月小鼠

全脑

盐水灌注,10天

5月小鼠

半球

无灌注,11-12天   盐水灌注,11天

 

组织块的类型和大小的不同可能影响浸渍时间,理想的时间应该通过实验研究获得。在大多数情况下较好的浸渍效果是在2周。如果浸渍超过2周,则可能出现非特异性染色

 

2.浸渍后:浸渍准备好后,用蒸馏水或去离子水(dH2O)冲洗组织块,然后将其转移到套件B所制备的浸渍后缓冲液(30 g稀释在90 ml dH2O)中,并在室温下避光储存。 浸泡一天后更新溶液,继续浸泡一天。 在浸渍后2天后,将组织块准备好切片。

 

组织块可以在4°C的缓冲液中储存长达1个月

 

3.切片:可以使用振动切片机或类似类型的切片机将大脑切割成厚度为100-200μm的切片。

切片应收集在套件B制备的收集和安装缓冲液(30g试剂B,在500ml dH2O中稀释)中。

建议使用振动切片机或微切片机进行切片。如果切片机刻度范围为1-10,则将速度和振幅设置为4级。 建议在分析树枝状分枝和树突棘时使用100-200μm的厚度。 对于薄切片的切割(例如50μm),需将剃刀刀片浸入二甲苯中1-2分钟来去除刀片上的油渍。

切片过程可在温度设定在-16°C ~ -20°C的低温恒温器中进行。

 

4.安装:借助所提供的着色笔(大),将切片转移到装有收集和安装缓冲液的填充盘(例如95×15mm培养皿)中。 使用圆头笔(小),将切片安装在粘性显微镜载玻片上。 1个载玻片上可安装6~12个切片。

覆盖切片:用吸水纸(例如滤纸)覆盖湿的切片,然后通过轻压载玻片来给吸水纸压力,以增强切片与载玻片的粘附。

在室温下风干燥切片约1分钟。 长时间暴露在干燥空气中会导致切片破碎。

将载玻片存放在干燥且封闭的染色罐中(已提供)。 放置在封闭的染色罐中的载玻片可以在室温下储存一天。一个染色罐可以存储多达10个载玻片。

 

5.染色:用0.01M PBS-T洗涤载玻片20~30分钟,然后用dH2O洗涤约1分钟。 将载玻片置于用dH2O稀释后的溶液C(体积比 3:5)中,在封闭的染色罐中保持20±2分钟(将罐子储存在黑暗区域中),然后将载玻片在dH2O中漂洗约1分钟。

 

如“试剂盒提供的材料”中所述:溶液C必须在使用前用dH2O(体积比为3:5)稀释。例如,将18ml溶液C与30ml dH2O混合,形成48ml工作溶液。试剂盒中提供染色罐可刚好装下所制备的48ml工作液。48ml工作液可用于多达120个切片(例如,在所提供的染色罐中总共10个载玻片,每个载玻片黏附有12个鼠脑切片)。

 

为获得最宜效果,请勿重复使用稀释的工作溶液。

为了防止切片滑落,切勿在dH2O中长时间洗涤。理想的染色时间应由实验研究获得。通常较好的染色效果是在20分钟左右。

 

6.复染色:将载玻片置于试剂D制备复染缓冲液中,在暗中放置20分钟后在0.01M PBS-T中洗涤10分钟×3次。

(可选染剂:在PBS-T洗涤后,切片可用甲酚紫、甲基绿或其他合适的染色试剂复染。)

用dH2O冲洗载玻片约1分钟,然后风干。当切片不完全干燥(通常需要5~10分钟)时,将载玻片存放在干燥且封闭的染色罐中,或继续下一步操作“清洁和覆盖”。

载玻片可以在室温条件下储存在罐中一天。

为了防止长时间暴露在干燥空气导致切片的碎片化,需将载玻片存放在干燥且封闭的染色罐中。

48ml复染缓冲液可用于多达120个切片(例如,如“5.染色”中所述,在染色罐中的12个切片×10个切片)。 为获得最宜效果,请勿重复使用工作溶液。

 

7.清洁和覆盖:将载玻片在100%乙醇中脱水约10分钟 ×4次。 在二甲苯或二甲苯替代物中清洗约10分钟 ×3次。 盖玻片采用的是Permount®封片剂。

superGolgi-染色用的切片储存在室温和黑暗区域。

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