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 技术文章
jenabioscience PP-101说明书
点击次数:66 发布时间:2019-10-25

 

Jena Bioscience由德国马普所(MPI)的分子生理学家于1998年共同创办的生物公司,致力为全球的科研院所、医院、制药企业以及诊断试剂盒生产企业提供各类试剂。在结构学研究方面全面提供晶体筛选试剂盒、优化试剂、工具和各类耗材等。

jenabioscience PP-101说明书

JBS dNTP-Mutagenesis Kit

JBS dNTP诱变试剂盒

dNTP类似物的随机诱变

 

货号规格价格(欧元)购买/注意
PP-10115反应260,16添加到购物篮/报价添加到记事本

图1:dPTP和8-Oxo-dGTP的结构
图1:dPTP和8-Oxo-dGTP的结构

图2诱变率与PCR循环数的关系[Zaccolo等]
图2:诱变速率与PCR循环数的关系[Zaccolo 等。]

仅用于体外

运输:在蓝色冰上运输

储存条件:在-20°C下储存,
避免冷冻/融化循环,强烈建议在使用前等分修饰核苷酸

保质期: 12个月

描述:
JBS诱变系列
在三十亿年的进化过程中,自然界通过反复反复的随机诱变循环,然后通过体内选择编码蛋白的卓越功能,自然产生了过多的蛋白。在过去的二十年中,这个自然进化的例子指导研究人员开发了蛋白质体外排列的策略。
在应用的各种策略中,出现了三种主要的强大技术。

dNTP类似物的随机诱变
此方法基于通过PCR将诱变的dNTP类似物(例如8-oxo-dGTP和dPTP)掺入扩增的DNA片段中。仅在四种天然dNTP的存在下,通过第二个PCR步骤消除了诱变dNTP,致突变率高达20%。
→ JBS dNTP诱变试剂盒#PP-101


由Caldwell&Joyce(1992)开发的Error-Prone PCR进行随机诱变该方法在引起DNA聚合酶错误率增加的条件下,利用PCR反应在目的基因中引入了突变。易错PCR的诱变率在0.6-2.0%的范围内。
→ JBS Error-Prone套件#PP-102

通过DNA
改组进行随机诱变 Stemmer(1994)开发的DNA改组通过随机分裂一个基因或一组相关基因来生成文库,然后在自引发PCR反应中重组片段。该方法允许重组来自不同相关基因的序列。诱变的总速率约为。0.7%。
→ JBS DNA改组试剂盒#PP-103

Jena Bioscience现在在单独的套件中提供了每种“即用型”技术所需的所有必要组件,并附有精简的文档,可很大程度地提高成功率。

含量:
Taq聚合酶(红色帽)
5单位/微升,40微升

诱变缓冲液(绿帽)
10x浓度,200μl

dNTP混合液(白色帽)
每个10 mM dNTP(dATP,dCTP,dGTP,dTTP),100μl

dPTP(黄色瓶盖)
10 mM,40μl

8-oxo-dGTP(蓝帽)
10 mM,40μl

PCR级水(白色瓶盖)
2x 1毫升

dNTP类似物
8-oxo-dGTP和dPTP的随机诱变是诱变的dNTP类似物,可使用Taq聚合酶通过PCR将其掺入DNA [Zaccolo 等。,Zang 等。]。
将8-Oxo-dGTP掺入模板腺嘌呤对面,产生两个过渡突变:A→C:T→G。诱变的总速率约为 据报道有2%(图2),其中A→C:T→G的比率约为1。1:1.5。

据报道,dNTP模拟物dPTP约为。诱变作用是8-oxo-dGTP的10倍(图2)。dPTP诱导的突变以大约5:4:1:1的比率发生(A→G:T→C:G→A:C→T),总诱变率高达19%。
由8-Oxo-dGTP和/或dPTP诱导的随机诱变在两步PCR过程中进行。首先,在四种天然dNTP加诱变类似物dPTP和/或8-Oxo-dGTP的存在下扩增目标DNA片段。诱变速率可以通过PCR循环数轻松控制(图2)。

然后,在不存在诱变类似物的情况下,将首轮PCR的产物进行第二轮PCR。该步骤在克隆和转化之前从靶DNA中消除了非天然类似物。

推荐的测定准备

  • 对于50μl反应,请在无菌小瓶中加入5μl10x诱变缓冲液
  • 添加最多25 fmol模板DNA和0.2-1μM合适的引物
  • 加入2.5μldNTP混合物
  • 加入2.5μl每个诱变类似物
  • 加入1μl(5 u)Taq聚合酶
  • 加入PCR级水至最终体积为50μl

推荐的热循环条件

变性92°摄氏度1分钟
退火55°摄氏度1.5分
延期72°摄氏度5分钟


循环数:5-30(请参见图2)
。诱变的速率主要取决于循环数(图2),并且可以通过诱变dNTP的数量进行微调[Zaccolo 等。]。

 

最终PCR
为了消除诱变性dNTP,在第二步PCR中使用等分的1μl首次PCR反应作为模板。取10x诱变缓冲液,并按上述相同浓度添加模板,引物,dNTP Mix和Taq聚合酶。装满PCR级水至50μl。
使用相同的热循环条件,但20-30个循环。

精选参考文献:
Zang 等。(2006)高效而高保真度的dCTP与7,8-dihydro-8-oxodeoxyguanosine相对,通过sololotarius DNA聚合酶Dpo4。Journal of Biological Chemistry281:2358。
Zaccolo 等。(1999)高频随机诱变对体外蛋白质进化的影响:TEM-1β-内酰胺酶的研究。J.摩尔 生物学 285(2):775。
Crameri 等。(1998)DNA改组从不同种类的基因家庭加速定向进化。自然 391:288。
Zaccolo 等。(1996)一种使用核苷类似物的三磷酸酯衍生物的混合物随机诱变DNA的方法。J.摩尔 生物学 255:589。
Stemmer(1994)通过DNA改组在体外快速进化蛋白质。自然 370:389。
Cadwell 等。(1992)通过PCR诱变使基因随机化。PCR方法。应用 2:28。

 

 

 

 

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