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 技术文章
leniobio AL0103500说明书
点击次数:60 发布时间:2019-10-30

LenioBio GmbH是一家专注于蛋白质表达解决方案的生物技术公司。LenioBio总部位于德国杜塞尔多夫,由商业资深人士和蛋白质表达专家于2016年成立。2018年三月,LenioBio签署了陶氏益农的许可协议,以推出自己专有的无细胞蛋白质表达技术下LenioBio品牌爱丽丝®。LenioBio目前正在进一步开发该技术,通过智能设计进行创新,以利用自然的力量来加速合成生物学。历史和背后的爱丽丝技术的特点®在技术部分描述。

在LenioBio,我们所做的一切都始于我们的使命:为客户提供创新的解决方案,以前所未有的轻松,快速和高效的方式应对最严峻的挑战。这种深切的承诺是我们的名字Lenio的核心,它源自拉丁语“缓解,减轻,改善”。

LenioBio –应用性更好的科学。

leniobio AL0103500说明书

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描述

“爱丽丝®是一个独特的真核无细胞系统,可以生成一个前所未有的3毫克/毫升在批处理模式的蛋白质,与市场上的其它真核无细胞系统,它仅产生0.1毫克/毫升或更小进行比较。即使是通常只能处理易于表达的蛋白质的原核无细胞系统,也只能以批处理方式产生1 mg / mL的蛋白质。”

技术指标

规格信息

套件组件

来源于植物细胞的细胞裂解液

保质期

12个月

贮存温度

-70°C至-80°C

活动验证

至少3毫克的表达/以下爱丽丝的手动时毫升增强黄色荧光蛋白的®

 

 

用户提供的设备和材料:

手套

•吸管过滤头(无核糖核酸酶)

•无核糖核酸酶的水(例如来自微孔过滤装置的水)

•轨道振动筛

o当在试管中进行反应时:

桌面摇床(2毫升容器插入物),摇床直径:3毫米或0,当在平板中进行反应时:

湿度控制(高达80%)的振动筛,振动直径:25 mm,带固定板和96个半孔板(无RNase)

 

运输和储存

Alice®套件采用干冰运输。到达后,立即按上表所示存放部件。在这些条件下,反应混合物至少稳定12个月。

产品使用限制

这个工具包仅供研究之用。不得用于疾病的诊断、预防或治疗,也不得用于人类。请参阅我们网站上的有限使用标签许可证(LULL):

产品保修

工具包是用干冰冷冻运输的。如果交货时包装内没有干冰,或者包装损坏,则可能会影响套件的质量。如果交货有任何问题,请立即与我们联系。保修有效期至产品标签上注明的到期日。

质量管理

高质量的化学品和材料已被用于制造该套件的组件。每批产品都经过仔细的测试,以确保所有部件都符合规定的规格(见分析证书)。

安全

使用者应遵守处理化学品和重组DNA的所有适用法规。处理套件组件时,应穿戴实验室工作服、安全眼镜和手套。处理超冷材料时,请戴上额外的防护手套,以免冻伤。使用过的部件应按照当地法规进行处理。

免责声明

对于因使用、误用或因使用本工具包而造成的任何直接或间接损害或损失,我们不承担任何责任。

介绍

从粗细胞提取液中提取的无细胞蛋白表达(cfpe)系统作为一种研究工具已经应用了几十年,并在蛋白表达技术中引入了许多诱人的优势。

然而,采用cfpe系统替代细胞法的一个关键障碍是蛋白质产量相对较低的问题。

为了解决这个问题,Leniobio利用植物细胞生物学的优势,引入了一种新的真核细胞自由表达系统:Alice。Alice®在批处理模式下提供前所未有的高达3毫克/毫升的蛋白质产量。因此,它能让你克服活体宿主系统的限制,在数小时内而不是数周内获得“难以产生”的蛋白质。系统的优点

其中包括:

•高产:高达3 mg/ml的表达蛋白

•易于使用:一步反应方案

•快速:仅需48小时即可获得高产量

灵活:表示“难以生产”蛋白质、细胞毒性蛋白等。爱丽丝®利用烟草细胞裂解物,耗尽空泡。该系统包含体外转录所需的所有因子(rna聚合酶,ntps)和翻译反应(核糖体,翻译起始/延伸因子,trna等)。使用一个简单的协议,rna转录和翻译都发生在一个单管(耦合转录/翻译)。

反应是通过简单地混合质粒DNA与爱丽丝®反应混合物开始的。Alice®卓越的蛋白质产量基于反应期间高效的蛋白质表达。因此,我们建议反应持续时间为48小时。Alice®提供了两种表达载体,即PALICE01和PALICE02,它们是根据感兴趣蛋白质的靶向性而使用的(见第5页)。当与Alice®表达系统一起使用时,它们被特别定制以提供卓越的蛋白质产量。PALICE01用于在ALICE®胞质部分中的表达。以palice02为靶向微粒体提供了通过翻译后修饰如二硫键来表达蛋白质的机会。

除筛选外,alice®系统还可用于大规模表达靶蛋白。

Alice®系统的潜在附加应用包括:

•目标蛋白特性

•蛋白质优化

•突变筛选

•蛋白质-蛋白质相互作用

•表达分析

•蛋白质定位分析

•蛋白质结构分析

•翻译后修饰分析

•代谢组学

•除草剂筛选

 

Alice®表达式向量

Alice®提供了两个不同的表达式向量:palice01和palice02。palice01作为细胞溶质表达载体,而palice02使用信号肽作为微粒体靶向。

微粒体是在Alice®反应混合物的制造过程中,由部分内质网形成的类似细胞器的结构。利用蜂毒素信号肽,蛋白质可以转运到这些细胞器中(Buntru等人,2014),在那里进行翻译后修饰。随后,微粒体可以被破坏以恢复表达的蛋白质(见第9页)。palice01和palice02也可以作为表达的阳性对照,分别在细胞溶胶和微粒体中加入alice®反应混合物时表达eyfp。

克隆成栅栏载体制备模板

下面提供了包含PALICE01和PALICE02载体特征的地图(图1),以及感兴趣基因5'和3'方向克隆侧的扩展视图(图2和图3)。

克隆位点允许在t7启动子和5'未翻译区后面插入感兴趣的基因。克隆你感兴趣的基因既可以从现有的载体中分离出来,也可以通过PCR扩增其编码区域来引入适当的限制酶位点。

细胞溶质表达质粒palice01的推荐限制位点为ncoⅠ和kpn i,而微粒体表达质粒推荐限制位点为ncoⅠ/noti或ncoⅠ/kpni。如果使用kpn i进行克隆,请确保打开的阅读框包含一个停止密码子。

dna的纯化

为了促进高效的转录-翻译反应,需要高纯度的质粒dna制备。因此,强烈建议使用基于阴离子交换色谱法的质粒制备程序(例如Macherey Nagel的Nucleobond®Xtra Midi)。对于基于二氧化硅基质的质粒dna制备试剂盒,我们建议在转录-翻译反应之前添加rnase抑制剂或苯酚氯方纯化模板。根据插入物的大小,通过添加适当体积的5 mm Tris缓冲液(pH8.5),将最终质粒DNA调整到所需浓度。反应混合物中的最终浓度应为5nm。在-20℃下分批储存。耦合转录/翻译反应设置耦合转录-翻译反应的典型反应体积为50微升。

1)选择反应容器:

•Alice®试管=每次反应52微升

•96个半孔板,每个反应的Lid1=50微升

2)准备DNA

从仓库中取出质粒dna模板,并在室温(20-25°C)下解冻。轻轻搅拌,翻转并快速向下旋转,收集试管底部的内容物,然后放在冰上。稀释或浓缩质粒,组装反应的最终浓度应为5nm。dna浓度对蛋白质产量有显著影响。

3)解冻Alice®反应混合物

从仓库中取出Alice®反应混合物,并在室温(20-25°C)水浴中解冻。通过倒置试管轻轻混合。不要旋涡!解冻后直接放在冰上。解冻后30分钟内开始反应。将剩余的裂解液直接冷冻在-80°C。不要使用液氮!避免一次以上的冻融循环!

 

 

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