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 技术文章
neuroprobe Z02说明书
点击次数:40 发布时间:2020-04-22

neuroprobe Z02说明书

神经探针Z02

  • 一般说明
  • 使用Z02的视觉检测,由Sally Zigmond提供
  • 故障排除
  • 注意和警告

一般说明

在对使用Z02腔室的过程进行一般描述之后,将给出描述该腔室在特定类型的实验中的用途的特定协议。

通常,将一滴悬浮的细胞放在盖玻片的中间。电池粘附后,将干玻璃的末端擦干,在6mm宽的湿部分留有粘附的电池。

将以此方式制备的盖玻片倒置到带凹槽的显微镜载玻片上,以使细胞覆盖部分位于凹槽之间的桥上方。安装夹具后,将细胞悬浮介质和趋化因子吸移到两个凹槽中,直到充满并没有气泡为止。

然后孵育室。

经过适当的时间(取决于细胞类型和实验目标)后,将玻片置于显微镜下,观察并定量细胞的方向。迁移细胞的内部结构也可以通过使用高功率光学显微镜来研究。

使用Z02的视觉检测,由Sally Zigmond提供

  1. 每次使用前都要清洁腔室。用组织培养清洁剂在温水中洗涤,用蒸馏水冲洗干净并擦干。也可以用70%或95%的ETOH擦拭桥接器。
  2. 在22mm x 40mm盖玻片的中心放置一滴血(例如,用手指刺)。必须在每个盖玻片上放置足够的血液,以使其凝结并部分缩回而不干燥。每个盖板玻璃大约需要100 µL
  3. 将带血的盖玻片放在有或没有CO 2的 37°C的潮湿室内(例如,装有湿滤纸的培养皿中)。
  4. 大约45分钟后,血液凝结并开始收缩,并且在边缘周围可见液体。此时,可以用0.9%的盐水轻轻冲洗掉血和红细胞。单层细胞(主要是嗜中性粒细胞)保留在盖玻片上。不要让细胞干燥。
  5. 通过将明胶溶解在沸腾的去离子水中制备10%的明胶原料。加热原料使其熔化,并用已除去碳酸氢盐的Hanks培养基以1:10的比例稀释,并用pH 7.2的HEPES缓冲液(2.40 g HEPES /升)代替。用Hanks稀释时,请确保明胶确实在溶液中。该介质是弱酸性和低渗的。这些条件有助于良好的细胞运动。碱性pH和高渗具有抑制作用。
  6. 用几滴这种孵育培养基冲洗盖玻片上的细胞层。快速排出盖玻片上的液体,用Kimwipe擦干盖玻片的端部,然后将盖玻片倒置到培养箱中,使细胞位于桥上。
  7. 将夹子放在玻璃显微镜盖玻片组件的每一侧。不要移动防护玻璃 ; 任何移动都会溶解桥上的细胞。腔室组件需要一些练习。在细胞上的液体最少(但不允许细胞干燥)的情况下,盖玻片和桥之间的距离将非常薄;5微米是最宜选择(细胞会出现轻微挤压)。如果该间隙太大,则细胞将不能很好地定向。可以使用显微镜的微调旋钮上的千分尺,通过桥顶部和盖玻片底部之间的焦平面差来测量间隙。通过练习,您可以从一侧放下防护玻璃。这有助于消除桥上的气泡;它们会干扰细胞方向。
  8. 盖好玻璃盖后,用移液管吸取100 µL介质到其中一个凹槽的开口端。用移液管吸取100 µL趋化因子(或阴性对照室的细胞悬浮介质)到另一个槽中。
  9. 在37°C下孵育约20分钟,以使细胞产生反应。(对于其他细胞类型,可能需要更长的孵育时间。)
  10. 使用40X相的物镜观察桥上的单元并评估单元方向。方向可以通过细胞形态来评分。运动细胞的前部有宽阔的lamellipodium,而尾巴则较细,可以呈球形或拉入回缩纤维。如果腔室在室温下冷却一段时间,则细胞会聚拢并且更难以刻划。当细胞运动良好时,方向最容易得分。
  11. 方向应在桥的特定位置(趋化剂侧,中间或介质侧)评分。取向水平可以在桥的整个宽度上变化很大,这取决于化学引诱剂的浓度。沿着桥扫描给定的腔室,直到至少刻划了100个细胞。

故障排除

许多伪像可以更改在给定字段中看到的方向级别。

  1. 与气泡和细胞团相邻的细胞趋于特异。这些因素改变了化学梯度的影响。
  2. 如果细胞不形成极化形态,则它们可能死在桥上,但在凹槽上还活着。这可能是由于桥脏造成的,或者制备物太薄以至于细胞实际上已经被溶解了。
  3. 如果细胞形成极化形态但没有定向,请检查桥和盖玻片之间的间隙是否足够薄。如果间隙合适,请尝试使用其他浓度的化学引诱剂。

注意和警告

Zigmond玻璃滑动腔非常脆弱,很容易折断,因此在操作和使用时要格外小心。固定盖玻片的夹具具有可插入显微镜载玻片孔中的销钉。贴合性好,因此要取下它,可能需要在提起夹具时顺时针旋转旋钮。切勿尝试撬开销钉。

腔室配有一个小内六角扳手。如果销钉不太容易拧出,请将其翻转过来,将扳手插入销钉底部的六角孔中,然后将其旋转。与拉动销钉相反,转动销钉可大程度地减少碎玻璃的机会。

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