如何在RT-PCR过程中避免DNA污染？ 用arcticzymes公司Heat＆Run gDNA去除试剂盒

PCR主混合物的去污

PCR是在研究和诊断中检测DNA存在的灵敏方法。PCR中使用的聚合酶经常被大肠杆菌  DNA 污染  。当靶向少量细菌DNA时，污染的DNA可能会导致灵敏度降低和假阳性。其他污染源可能是dNTP，缓冲液成分和引物/探针，以及在处理过程中引入的DNA。细菌的检测和分型可以通过使用针对保守区域（即16S或23S rDNA基因）的宽范围引物进行。该方法对细菌DNA污染非常敏感，在大多数预混液和聚合酶中都可以发现细菌DNA的痕迹。当使用qPCR检测或定量少量细菌DNA时，会污染  大肠杆菌 DNA可能导致假阳性结果。

Master mix AMaster mix BMaster mix CMaster mix DMaster mix EMaster mix F5101520253035404501,0002,0003,0004,0005,0006,000CyclesFluorescence (dR)

图1：通过使用水代替模板（NTC）并按照制造商的说明对来自不同供应商的2x探针预混合物中大肠杆菌23S DNA的存在进行了定量。该图显示了来自几个单独实验的图。在所有测试的预混物中都发现了痕量的大肠杆菌23S DNA，Cq值通常在30-35之间。

为了解决这个问题，我们开发了一种简单而又准确的  PCR去污试剂盒  ，该试剂盒可去除主混合物中的污染DNA，而不会降低PCR灵敏度

PCR Decontamination Kit

PCR去污试剂盒

PCR去污试剂盒可去除PCR预混液中的污染DNA，而不会降低PCR灵敏度。

• dsDNase的双链特异特性允许使用引物和探针进行去污染。
• 高效用于终点PCR和基于探针的qPCR。
• 污染的细菌DNA降至检测极限以下的水平。
• 快速简便的协议。

在不降低灵敏度的情况下对母料进行去污一直是一个挑战。尤其是当靶向少量DNA时，污染DNA是一个主要问题。由去污方案在qPCR分析中造成的任何灵敏度损失都是不可接受的。

协议

1. 将引物和探针与主要混合物和试剂盒内容混合
2. 在37°C下孵育20分钟
3. 在60°C下失活20分钟
4. 添加模板并运行qPCR

在存在DTT的情况下，dsDNase在60°C时不可逆地失活，从而确保失活后添加的任何模板都对消化没有影响。

用于从20 µl反应中去除污染性DNA的方案，但可以通过调整试剂盒内容物的体积来按比例放大或缩小。

图1： PCR去污试剂盒方案

500 pg untreated50 pg untreated5 pg untreated500 fg untreated50 fg untreatedNTC untreated500 pg decontaminated50 pg decontaminated5 pg decontaminated500 fg decontaminated50 fg decontaminatedNTC decontaminated5101520253035404502,5005,0007,50010,00012,50015,000Cycles

图2：未经处理和去污的qPCR 2x预混液用于以5步分析10倍的大肠杆菌gDNA连续稀释液。包括NTC样品，连续稀释的所有图均显示三个重复的平均值。

使用PCR Decontamination Kit进行处理不会降低PCR的敏感性。即使稀释DNA，Cq水平也没有明显改变（图2）。

套件内容

• DTT（灭活援助）
• dsDNase（100个反应）

储存条件：储存于-20˚C。
样品材料：该试剂盒可用于减少普通PCR和基于探针的qPCR混合物中的污染DNA。对于某些基于SYBR的qPCR混合物也很有效。
质量控制：已  对试剂盒中是否存在RNase进行了测试。

双链特异性DNase

双链特异性DNase（dsDNase）是*的双链特异性核酸内切酶。由于它们不消化ssDNA或RNA，因此可用于在其他核酸存在下特异性去除dsDNA。该酶是热不稳定的，因此使其成为必须使DNase失活的应用的理想选择。该酶有两种版本，dsDNase和HL-dsDNase。

不含甘油和Triton FREE的版本

dsDNase和HL-dsDNase现在可用

物产

对双链DNA的
特异性已对双链和单链DNA和RNA寡核苷酸测试了核酸特异性。

使用具有5'处FAM和3'（Eurogentec）的FAM的15-mer寡核苷酸测量了dsDNase对底物的特异性。荧光与酶活性成正比。

测定条件：25 mM Tris pH 7.5、5 mM MgCl 2和2μM寡核苷酸。

相对活动

从上面的数据可以得出结论，dsDNase是双链特异性的。

dsDNase

热失活
dsDNase可以通过在65°C下15分钟或60°C下20分钟的热处理进行热灭活。该酶需要1 mM DTT和pH≥8才能*灭活。

技术指标

• 单位定义
  一个单位定义为在100 mM醋酸钠pH 5.0和5 mM MgCl2中使用50 µg / ml高分子量DNA在260 nm处的吸光度每分钟增加0.001。
• 比
  活Ca。400 000 Kunitz单位/毫克
• 活性
  dsDNase在20-40°C的温度范围内具有很高的活性。它至少需要2.5 mM Mg的活性，并具有7.5的pH。
• 储存缓冲液
  20 mM Tris-HCl pH 7.5、2 mM MgCl2、10 mM NaCl，0.01％（v / v）Triton X-100、50％（v / v）甘油。
• 纯度
  dsDNase被纯化至明显的同质性。
• 储存
  -20°C时，小储存期限为3年。在4°C下可以保存至少6个月。该酶还耐受多个冻融循环。

HL-dsDNase

热失活
HL-dsDNase可通过在58°C下5分钟的热处理进行热失活。该酶需要1 mM DTT和pH≥8才能*灭活。

技术指标

• 单位定义
  一个单位定义为在100 mM乙酸钠pH 5.0和5 mM MgCl2中使用50μg/ ml高分子量DNA在260 nm处的吸光度每分钟增加0.001。
• 比
  活Ca。200 000 Kunitz单位/毫克
• 活性
  HL-dsDNase在20-40°C的温度范围内具有很高的活性。它至少需要2.5 mM Mg的活性，并具有7.5的pH。
• 储存缓冲液
  20 mM Tris-HCl pH 7.5、2 mM MgCl2、10 mM NaCl，0.01％（v / v）Triton X-100、50％（v / v）甘油。
• 纯度
  HL-dsDNase被纯化至明显的同质性。
• 储存
  -20°C时，小储存期限为2年。该酶还耐受多个冻融循环。

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