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 技术文章
proteinslides Ni-NTA或Cu-NTA表面
点击次数:69 发布时间:2020-11-12

proteinslides Ni-NTA或Cu-NTA表面

应用说明: 

蛋白质分子仅通过具有受控方向的poly-His标签连接到表面,否则将尽可能远离表面。这确保了天然状态的蛋白质活性。无需样品预纯化。

图1.零背景Cu2 +表面由束缚在高密度PEG涂层上的螯合Cu2 +离子组成。蛋白质分子通过多组氨酸标签特异性连接。 

重组蛋白通常与聚组氨酸(His)标签一起产生,以促进纯化。这些蛋白质现在用于蛋白质微阵列的制造中。为了利用poly-His标签的可利用性,我们基于零背景PEG涂层开发了一种螯合的Cu2 +表面,如图1所示。该表面的使用基本上省去了纯化步骤,并将其直接掺入了蛋白质固定化过程,即可以将粗裂解物直接用于微阵列制造,如图2所示的绿色荧光蛋白(GFP)。除了N末端或C末端的多组氨酸标签外,由于PEG环境的排斥性,每个固定的蛋白质分子都远离表面并使其与表面的相互作用最小化。结果是,对蛋白质天然构象的干扰最小。化学环境的惰性和可控的取向都为固定的蛋白质分子保留其天然构象和活性提供了理想的环境,如图3所示。对于6xHis标记的磺基转移酶和碱性磷酸酶,可控的取向固定在Cu2 + / PEG表面,其活性与溶液相几乎相同。为了进行比较,以无规取向固定在3-氨丙基三乙氧基硅烷(γ-APS)涂层表面上的酶仅显示约10%的活性。化学环境的惰性和可控的取向都为固定的蛋白质分子保留其天然构象和活性提供了理想的环境,如图3所示。对于6xHis标记的磺基转移酶和碱性磷酸酶,可控的取向固定在Cu2 + / PEG表面,其活性与溶液相几乎相同。为了进行比较,以无规取向固定在3-氨丙基三乙氧基硅烷(γ-APS)涂层表面上的酶仅显示约10%的活性。化学环境的惰性和可控的取向都为固定的蛋白质分子保留其天然构象和活性提供了理想的环境,如图3所示。对于6xHis标记的磺基转移酶和碱性磷酸酶,可控的取向固定在Cu2 + / PEG表面,其活性与溶液相几乎相同。为了进行比较,以无规取向固定在3-氨基丙基三乙氧基硅烷(γ-APS)涂层表面上的酶仅显示约10%的活性。

图3.溶液相中酶活性与在γ-APS表面上随机取向或在Cu2 + / PEG表面上受控取向的酶活性的比较。图2.左侧显示了吸附在螯合的Cu2 + / PEG表面的6xHis标签的GFP的固有荧光。该表面可抵抗没有His标签的GFP的非特异性吸附(右)。光斑直径约0.2毫米。

Cu2 + / PEG表面上的排斥性2D化学环境不仅对固定化蛋白分子的活性至关重要,而且对维持和恢复这种活性也至关重要。后者在固定在三个不同表面上的6xHis-GFP变性和重新折叠的重复循环后的荧光显微镜图像中得到证明(图4):(a)Cu2 + / PEG表面;(b)Cu 2+离子螯合在3-氨基丙基三乙氧基硅烷(gama-APS)功能化表面的表面亚氨基二乙酸基团上;(c)用于非特异性蛋白质吸附的γ-APS表面。尽管免疫染色显示相似量的GFP,但三个表面的固有荧光强度却有很大差异。Cu2 + / gamma-APS或gamma-APS表面的荧光强度为70%或< Cu 2+ / PEG表面的20%。尽管在变性步骤之后所有三个表面上均未检测到荧光,但重新折叠的结果是表面化学性质的强函数。在Cu2 + / PEG表面上,大多数荧光强度在重折叠步骤后得以恢复。相反,Cu2 + /γ-APS或γ-APS表面几乎没有荧光强度。在Cu2 + / PEG表面上,每个固定的GFP分子仅通过6xHis标签连接,但由于PEG功能的排斥性,更倾向于远离表面。表面的这种排斥或不结垢的性质确保了弱的蛋白质-表面相互作用不会在能量格局中为蛋白质重新折叠引入额外的障碍。在gamma-APS表面上,GFP与附近的“粘性”或结垢–NH2官能团之间存在吸引人的非特异性相互作用。变性后,与粘性环境的这种非特异性相互作用有望增加,从而有效地在能量格局中引入了无法克服的障碍,从而使蛋白质重新折叠。Cu2 + / PEG表面对蛋白质分子进行芯片重折叠的能力为许多潜在应用打开了大门,例如,直接在芯片上生成蛋白质微阵列,从重组蛋白质中去除包涵体等。这些涂层可供选择在标准显微镜载玻片,盖玻片和硅片上。我们的客户已成功将Cu2 + / PEG表面应用于各种应用,包括蛋白质传感器,蛋白质微阵列,单分子光谱,生物原子力显微镜和其他生物物理研究。即将推出:Cu2 + / PEG表面的三维(3D)版本正在开发中。微孔3D涂层提供的大表面积允许高聚His标签探针分子的高负载。这是检测极低浓度生物标志物的理想选择。

图4.在三个表面上变性(De)和再折叠(Re)循环前后的6xHis-GFP荧光显微镜图像:(a)Cu2 + / PEG;(b)Cu2 //γ-APS;(c)γ-APS。变性涉及将6xHis-GFP涂层的表面浸入pH = 3.5的缓冲溶液中,而重新折叠对应于将样品与含有1xPBS,20%蔗糖和10%甘油的pH = 8.1的缓冲溶液一起孵育。

阅读使用我们的Cu2 +表面发表的文章:蛋白质组学,2005,5,416;蛋白质组学,2007,7,1771; 自然方法,2008,5,507; BMC Biotech。,2009,1.等。

 

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