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Abbexa abx151519说明书
点击次数:87 发布时间:2020-11-23

Abbexa  abx151519说明书

 

 

人成纤维细胞生长因子19(FGF19)ELISA试剂盒

 目录号:abx151519

尺寸:96T

范围:15.6 pg/mL-1000 pg/mL

 

灵敏度:< 5.7 pg/mL

 

储存:96孔板、标准品和检测试剂在-20 ℃下储存,试剂盒的其余部分在4 ℃下储存。

 

应用:定量检测人血清、血浆、组织匀浆、细胞裂解液、细胞培养上清液等生物体液中的FGF19。

检测原理:本试剂盒基于夹心酶联免疫吸附试验技术。将抗体预包被在96孔板上。向孔中加入标准品、供试品和生物素结合试剂并孵育。然后加入HRP结合试剂,并孵育整个平板。在每个阶段使用洗涤缓冲液除去未结合的结合物。TMB底物用于定量HRP酶促反应。加入TMB底物后,只有含有足量FGF19的孔才会产生蓝色产物,然后加入酸性终止液后变为黄色。黄色强度与平板上结合的FGF19量成正比。采用分光光度法在酶标仪中测定450 nm处的光密度(OD),据此计算FGF19的浓度。

 

试剂盒组分

• 预包被96孔微孔板:12 x 8

• 标准品:2管

• 标准稀释缓冲液:20 mL

• 冲洗缓冲液:(30X)20 mL

• 检测试剂A:(100X)120 μL

• 检测试剂B:(100X)120 μL

• 稀释剂A:12 mL

• 稀释剂B:12 mL

• TMB底物:9 mL

• 终止液:6 mL

• 封板机:4

需要但未提供的材料

• 37 °C培养箱

• 多通道和单通道移液器和无菌移液器吸头

• 喷射瓶或自动微孔板洗板机

• 1.5 mL试管

• 蒸馏水

• 吸水性滤纸

• 100 mL和1 l量筒

• 0.01 mol/L PBS(pH 7.0-7.2)

• 酶标仪(波长:450 nm)

• ELISA振荡器

 

方案

A. 样品制备

 

立即分析或在2-8 ℃下储存样品(24 h内)。对于长期储存,等分并储存在-20 ℃或-80 ℃下。避免多次冻融循环。

血清:应将样本采集至血清分离管中。将试管垂直放置在4 ℃下过夜或在室温下静置1 h,凝固血清。以约1000×g离心20分钟。如果出现沉淀,再次离心。立即测定或等分并储存在-20 ℃或-80 ℃下。

血浆:使用EDTA或肝素作为抗凝剂采集血浆。采集后30分钟内,以1000 xg离心15分钟。如果出现沉淀,再次离心。避免使用溶血样本。

组织匀浆:组织匀浆的制备因组织类型而异-这只是一个例子。用冰冷PBS冲洗组织,以除去过量血液。均质化前称重。将组织切碎,在冰上用组织匀浆器在PBS中匀浆化,并对细胞悬液进行超声处理。以5000×g离心匀浆5分钟,收集上清液。

细胞裂解液:用胰蛋白酶分离贴壁细胞,离心收集,除去上清液。在冰冷PBS中清洗细胞3次,并在PBS中重悬细胞。超声裂解细胞4次,或-20 ℃冷冻,解冻至室温3次。在2-8 ℃下以1500×g离心10分钟,除去细胞碎片。收集上清液。

细胞培养上清液:以约1000×g离心20分钟,除去沉淀。

其他生物液体:以约1000×g离心20分钟,除去沉淀。立即分析或分装并储存在-20 ℃或-80 ℃下。

备注:

 

必须稀释样本,使预期浓度在试剂盒范围内。用0.01 mol/L PBS(PH = 7.0-7.2)稀释样品。

始终使用无热原、无内毒素的采血管采集血液。

建议使用新鲜样本或近期获得的样本,以防止可能导致错误结果的蛋白质降解和变性。

NaN3不能用作供试品防腐剂,因为它抑制HRP。

如果手册申请中未指明样本,则需要进行初步实验以确定试剂盒的适用性。

B. 试剂制备

 

标准品溶液:用1.0 mL标准稀释缓冲液制备标准品溶液,制备4000 pg/mL标准品溶液。将复溶的标准品静置10分钟,轻轻搅拌,然后进行系列稀释。避免产生泡沫或气泡。进一步稀释4倍得到高浓度标准品1000 pg/mL。在用于系列稀释的试管上贴上标签-参见下图以供参考。向各试管中等分0.5 mL标准品稀释剂缓冲液(高浓度标准品试管除外)。向第1支试管中加入0.5 mL高浓度标准品溶液,充分混匀。从第1个试管转移0.5 mL至第2个试管,充分混匀,以此类推。

注:复溶期间不得涡旋标准品,因为这会使蛋白质不稳定。标准品复溶后,应在15分钟内使用。不建议重复使用复溶的标准品。

清洗缓冲液:用蒸馏水将浓缩清洗缓冲液稀释30倍(1/30)(即,将20 mL浓缩清洗缓冲液加入580 mL蒸馏水中)。如果在浓缩清洗缓冲液中形成晶体,则加热至室温并轻轻混合,直至晶体完全溶解。

 

检测试剂A工作溶液制备:实验前制备不超过15分钟。

1. 计算所需工作溶液的总体积。

2. 用稀释剂A将检测试剂A稀释100倍,充分混匀。移液器动作缓慢、平稳,可减少体积误差。

 

检测试剂B工作溶液制备:在实验前制备不超过15分钟。

1. 计算所需工作溶液的总体积。

2. 用稀释剂B将检测试剂B稀释100倍,充分混匀。移液器动作缓慢、平稳,可减少体积误差。

 

C. 试验方案

 

按照上文所述制备所有标准品、样品和试剂。使用前,将试剂盒组分和样本平衡至室温。建议重复测量两次,并绘制每个试验的标准曲线。

  • 在预包被板上分别设置标准孔、供试品孔和对照(零)孔,记录其位置。在不接触侧壁的情况下,将溶液添加到每个孔的底部。在加入到孔中之前,将标准品和样品上下吸移混匀。避免产生泡沫或气泡。

2. 将100 μL稀释标准品等分至标准品孔中。

3. 将100 μL标准稀释缓冲液等分至对照(零)孔中。

4. 将100 μL适当稀释的样品等分至供试品孔中。轻敲微孔板混匀,或使用微孔板振荡器。

5. 用封板覆膜覆盖微孔板,并在37 ℃下孵育1 h。

6. 取下盖子,弃去液体。请勿清洗。

7. 向各孔中分装100µl检测试剂A工作溶液。用封板覆膜覆盖微孔板,并在37 ℃下孵育1 h。

  • 取下盖子,弃去溶液。用清洗缓冲液清洗微孔板3次。使用多通道移液器或自动清洗器,用清洗缓冲液(300 μL)完全填充每个孔(建议浸泡1-2分钟)。每个步骤完全去除液体对于良好性能至关重要。最终清洗后,通过抽吸或倾析除去任何剩余的清洗缓冲液。倒置微孔板,在干净的吸水纸巾上吸干。

9. 向各孔中分装100µl检测试剂B工作溶液。密封平板,并在37 ℃下孵育30分钟。

10. 取下盖子,弃去溶液,重复步骤8中描述的清洗过程5次。

  • 向各孔中分装90 μL TMB底物。用封板覆膜覆盖微孔板。轻轻敲击微孔板使其充分混合。在37 ℃下孵育10 min。孵育时间仅供参考,最终用户应确定最宜时间。避免暴露于光照下。

12. 向各孔中分装50µl终止液。重要的是,在整个微孔板中快速均匀地混合终止液,以完全灭活酶。

13. 确保平板底部没有指纹或水,孔中的液体无气泡。立即测量450 nm处的OD。

计算时,取各参比标准品和各样品的OD 450读数的平均值,然后减去平均对照(零)OD读数。

(相对OD)=(每个孔的OD)-(零孔的OD)

 

以各参比标准品溶液(X)的相对OD对各标准品溶液(Y)的相应浓度绘制标准曲线。可根据标准曲线内插样品浓度。如果测定的样品被稀释,则将内插得到的浓度乘以稀释因子,得到稀释前的浓度。

注意事项:

 

使用试剂盒前,离心试管,使盖中的内容物减少。

在两次孵育之间,请勿长时间暴露微孔。每个步骤的试剂添加时间不得超过10分钟。

在孵育步骤期间,确保平板正确密封或覆盖,并且时间和温度受控。

 

请勿重复使用移液器枪头和试管。

请勿使用过期组件或来自不同套件的组件。

TMB底物应在无菌条件下使用,并尽量减少光暴露。未使用的底物应为无色或浅黄色。请勿将任何残留溶液丢弃回小瓶中。

请注意,该试剂盒经过优化,可用于检测天然样本,而不是重组蛋白或合成化学品。我们无法保证重组蛋白的检测,因为它们可能与天然蛋白具有不同的序列或三级结构。

精密度:

 

试验内精密度(试验内精密度):3份含低、中和高水平FGF19的样本分别在一个平板上检测20次。

试验间精密度(试验间精密度):在3个不同平板上检测低、中和高水平FGF19的3份样本,每个平板8份重复样本。

CV(%)=(标准偏差/平均值)×100批内:CV < 10%

批间:CV < 12%

 

D. 典型数据和标准曲线

 

提供的典型标准曲线数据仅用于演示目的。必须为进行的每次分析生成新的标准曲线。

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