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agrisera AS08 300提取缓冲液说明书
点击次数:78 发布时间:2020-12-02

agrisera AS08 300提取缓冲液说明书

 

1 | PEB (4x) | protein extraction buffer

 AS08 300 |提取缓冲液,用于从植物组织和藻类/细菌细胞中定量分离总可溶性/膜蛋白,优化用于变性条件下的后续western blot检测

 

 

数量 5 x 2 ml(4x储备液)最多可分离75种植物材料(对于100 mg新鲜重量,使用500 µl 1x PEB)或190种藻类材料(对于总4-10 µg的细胞量,使用200 µl 1x PEB)叶绿素)

存储 在室温下稳定至少1个月;在4°C下短期存储(6个月),在-20°C下长期存储(1年或更长时间)

经过测试的应用 蛋白质提取

 确认反应性 PEB已在来自高等植物,苔藓,地衣,藻类,硅藻,鞭毛藻,蓝细菌的各种物种和组织上进行了测试。提取物可以使用去污剂(LDS)兼容的方法进行定量,并且在随后的SDS PAGE凝胶电泳,蛋白质印迹和免疫沉淀(IP)中已显示出高度可重复和定量的结果。

 应用实例 

开始之前,
通过在无菌去离子水中稀释4x储备液为所有样品准备足够的1x PEB(1x PEB的pH值应在8.25至8.75之间)。建议在准备立即使用的1x PEB时,从新鲜原料中加入蛋白酶抑制剂(此缓冲液不提供),以增加提取物中未降解蛋白质的产量。我们建议从新鲜制备的50x储备液(以1x PEB)中加入1:50体积/体积,以得到制造商推荐的所需最终浓度(例如,罗氏公司的Pefabloc SC为0.1 mg / ml)。

 

所需1x PEB的总体积取决于样品类型和所用组织的数量:对于100 mg新鲜植物组织,我们建议使用500 µl 1x PEB。对于藻类样品(相当于4-10 µg总叶绿素),我们建议200 µl 1x PEB。已发现将样品体积保持在0.2-0.5 ml范围内有助于获得更好的提取结果,不建议将样品体积增大。
 

材料准备

植物组织:称重并在液氮中速冻,并在-80°C下储存直至加工。
藻类培养物:离心形成沉淀或在过滤器(例如GF / F或聚碳酸酯)上收集并在-80°C冷冻直至进行处理。



 萃取

1个  

用杵将预冷冻的研钵中的液态N 2中的冷冻物质研磨成细粉,然后转移到1.5毫升试管中

在研磨过程中随时保持物料冷却,避免溢出

2  

加入1x PEB,立即将样品冷冻在液体N 2中

对于100 mg植物组织为500 µl,对于细胞为200 µl(对应于4-10 µg总叶绿素);保持试管直立以将样品固定在试管底部

3  

小心地对样品进行超声处理,直到样品融化为止,立即将样品重新浸入液体N 2中以避免加热

使用微超声仪(例如Branson Ultrasonics 450型)在约30%的低设置下可获得佳结果;也可以使用水浴超声仪,尽管这可能导致可再现的蛋白质回收率略有降低;

4  

根据不同的物种重复超声处理(3),置于冰上,直到处理完所有样品

对于高等植物,2-3个周期,蓝细菌3个周期,衣藻2个周期,异源,ThalassiosiraTrichodesmium 1个周期

5  

将样品以10000 xg离心3分钟以除去不溶物和未破碎的细胞,沉淀应为白色/浅灰色

沉淀物呈深绿色表示不是佳破碎方法,需要使用新样品调整提取条件(例如,改进研磨和/或重复超声处理步骤)

6  

用移液管将上清液转移到新管中,注意不要带走杂物

预计该植物的上清液约为400 µl,蓝藻/藻类样品的约为150 µl;用移液器收集上清液,因为2 x 200(或2 x 75 µl)降低了干扰沉淀的碎片的风险

蛋白质测定
使用去污剂相容性测定法测定回收的上清液的总蛋白质含量。根据所用物种的数量和/或组织,您可能期望蛋白质含量为1.5-6 µg / µl。


储存
蛋白质提取物可在+ 4°C下保存24小时,或在-20°C / -80°C下保存长达6/12个月。我们建议分装样品。重新冷冻蛋白质样品可能会导致降解/聚集。


装载在凝胶上
应将新鲜制备的还原剂(例如二硫苏糖醇,终浓度为50 mM)添加到准备装载的体积中。在70°C加热5分钟,短暂旋转并加样在凝胶上。0.5-5 µg /泳道的蛋白质负荷应足以满足大多数Western Blot应用的要求。

 附加信息 

缓冲液成分(4x):包含〜40%v / v甘油[HOCH 2 CH(OH)CH 2 OH],Tris-HCl [NH 2 C(CH 2 OH)3·HCl] pH 8.5,LDS [CH 3( CH 211 OSO 3 Li],EDTA [(HO 2 CCH 22 NCH 2 CH 2 N(CH 2 CO 2 H)2]
 

建议在准备立即使用的1x PSB时包括新鲜制备的蛋白酶抑制剂(此缓冲液不提供)。
 

PEB已针对从植物/藻类组织中提取全蛋白质提取物的定量小规模制备进行了优化。使用以下描述的程序进行提取将获得最大的蛋白质产量,并减少蛋白质的降解和聚集。

提取物可使用与​​去污剂(LDS)兼容的方法进行定量,并在随后的SDS PAGE凝胶电泳,蛋白质印迹和免疫沉淀中显示出高度可重复和定量的结果。

PEB已在来自高等植物,苔藓,地衣,藻类,硅藻,鞭毛藻和蓝细菌的多种物种和组织上进行了测试。

 

 背景 

PEB是一种提取缓冲液,用于破坏和溶解植物组织和藻类细胞中的总蛋白。与其他破坏细胞的方法相比,将阴离子去污剂LDS与推荐的程序(超声处理和冷冻/融化循环的组合)结合使用可增加溶解和未降解蛋白质的数量(请参阅参考资料)。对于1-2个样品,推荐步骤的预计动手时间为20-30分钟。预期的产量将为1.5-6 µg / µl总蛋白(从标准程序中回收),具体取决于原料,例如其生物学阶段,使用的均质化方法(打浆机与超声处理)。

 

 

 

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