DENARASE®ELISA试剂盒

用户说明

DENARASE ELISA试剂盒

ELISA法测定工艺衍生样品中的沙雷菌核酸内切酶。

仅供研究和生产使用。

将可能含有粘质沙雷氏菌核酸内切酶的样品在预包被有

特异性单克隆捕获抗体以及不同核酸内切酶的标准曲线

预期用途

浓度。孵育和清洗后-

该ELISA试剂盒预期用于体外定量测定粘质沙雷氏菌核酸内切酶。该检测可用于监测从工艺相关样品中去除核酸内切酶，如DENARASE®或Benzonase*核酸酶，以用于工艺开发和质量控制目的。该试剂盒仅供研究和生产使用，  不  预期用于诊断程序。

试验原理

该DENARASE ELISA试剂盒是一种夹心ELISA，在微量检测板形式中进行。

在除去未结合组分的步骤中，加入生物素结合的特异性单克隆检测抗体。进一步洗涤步骤后，结合的检测抗体与作为示踪剂的酶结合物反应。最终清洗步骤后，向孔中加入底物溶液并反应，导致显色。采用光度测定法测量光密度，其与孔中的分析物浓度成正比。可根据相应的DENARASE标准曲线计算未知样品中的核酸内切酶浓度。

表1：试剂盒中提供的试剂和材料

No.   试剂 详细信息 数量

1 微量检测板（即用型）

96孔（12条/8孔），用粘质沙雷氏菌核酸内切酶特异性单克隆抗体预包被

5个微孔板

3 稀释缓冲液(10×)

含有表面活性剂和防腐剂的Tris缓冲盐水，10×浓缩液

1 × 20 mL

5 检测抗体(100×)

在含有防腐剂的缓冲溶液中，与生物素结合的粘质沙雷氏菌核酸内切酶特异性单克隆抗体，

100×浓缩液

1 × 0.75 mL

7 底物溶液 TMB One底物溶液，即用型 1 × 75 mL

需要但未随儿童提供的材料和设备

用于稀释清洗缓冲液和稀释缓冲液的超纯水（至少双蒸水）（以10×浓缩液的形式提供）

用于清除微量测试平板清洗后残留液体的吸水纸巾

用于制备标准品、对照品和样品的适当试管

适用于清洗和稀释缓冲液的容器

适用于有效多通道移液的试剂槽

孵育步骤期间覆盖微量检测板的盖子

定轨微量测定板振荡器（约500 rpm）和涡旋混合器

Microtest洗板机（也可以手动清洗）

精密移液器（可调体积，10 μL至5000 μL），带适当枪头

带适当枪头的多通道移液器(100 μL)

试剂的储存

提供的所有试剂均应在2 ℃-10 ℃下冷藏保存，并应在失效日期前使用。

警告和注意事项

本试剂盒仅供研究和生产使用，仅应使用

由有资质的人员进行。

开始测定前，请仔细阅读说明书。

记录批号和失效日期。请勿混合不同批次的试剂。请勿使用过期试剂。

遵循药物非临床研究质量管理规范和安全性指南。必要时穿戴实验服、一次性手套和防护镜。

试剂制备

使用前将所有试剂和样本恢复至室温。

清洗缓冲液的制备(1×)

使用前，用超纯水以10×(2)1:10的比例对清洗缓冲液进行润滑（例如，100 mL 10×浓度溶液与900 mL超纯水混合）。洗涤缓冲液(1×)在室温下可稳定储存长达两周。

制备  的  稀释度  缓冲液  (1×)使用前用超纯水以1:10稀释10×浓缩液缓冲液(3)（例如，10 mL 10×浓缩液用90 mL超纯水稀释）。以下

稀释缓冲液(1×)在室温下可稳定储存长达2周。

试剂盒中的一些试剂含有Proclin®300 DENARASE标准品的制备

作为防腐剂。这些试剂可能引起眼睛和皮肤刺激，应谨慎处理。如果接触眼睛或皮肤，立即用水冲洗。

避光储存底物溶液。

终止液由0.5摩尔硫酸组成。该试剂具有腐蚀性，可能引起眼睛和皮肤刺激。应小心处理。如果接触眼睛或皮肤，立即用水冲洗。

应将剩余的试剂盒试剂和制备的溶液视为具有潜在危害。

符合国家的安全指南和法规的废物。

DENARASE ELISA的标准浓度应在进行测定前即刻使用试剂盒提供的DENARASE标准品(4)制备。标准品应仅在制备当天使用。

根据以下稀释方案，在稀释缓冲液(1×)中制备DENARASE ELISA标准品（pdi和S1-S8）：

标准品

浓度

抗原体积[μL] 体积稀释

ID [pg/ml]μL of

缓冲液[μL]

标准品

PD：预稀释；S：标准品

制备检测抗体工作溶液(1×)

稀释检测抗体100×浓缩液

(5) 用稀释缓冲液(1×)以1:100稀释。对于一个微量检测板，将120 μL 100×浓缩液与12 mL稀释缓冲液混合。该工作溶液应仅在制备当天使用。

酶结合物工作溶液的制备(1×)

稀释酶结合物100 x浓缩液

(6) 用稀释缓冲液(1×)以1:100稀释。对于一个微量检测板，将120 μL 100x浓缩液与12 mL稀释缓冲液混合。该工作溶液应仅在制备当天使用。

样品制备

应通过离心去除样品中存在的任何聚集体，以确保适当的分析性能。

一般而言，所有样品工作稀释液应仅在制备当天使用。

测定前，应使用稀释缓冲液(1×)稀释样本。最小样品稀释度应为1:2。

试验程序

所有ELISA步骤均在室温(18 ℃-26 ℃)下进行

使用前，使试剂盒中的所有材料和试剂达到室温。

在达到室温之前，请勿打开预包被微孔板(1)的箔袋。

试验中未使用的剩余平板条应重新装入含干燥剂的袋中。密封袋子，用于冷藏储存。在所有孵育步骤中，平板应盖上盖子（试剂盒未提供），以防止溶液蒸发和污染。

1. 培养  其中  标准品   和   样品：用100 μL/孔的DENARASE标准品和试验对照品填充微孔板，作为稀释样品，并在500 rpm下连续振荡孵育1小时。标准品、试验对照品和样品应至少重复分析两次。建议一式三份。

2. 清洗：

除去微孔内容物，用250 μL/孔的清洗缓冲液(1×)清洗微孔板4次。清洗后，倒置平板以倒出孔中的内容物。吸干并在干净的吸水纸上用力敲击，丢弃任何残留液体。

3. 用检测抗体孵育：

7. 用底物溶液孵育并终止：

加入100 μL/孔的底物溶液(7)，连续振荡孵育15 min。如果15 min后显色过低，底物孵育时间可延长至30 min。通过直接加入100 μL/孔的终止液(8)终止显色反应，得到黄色产物。

8. 测量：

用多通道酶标仪测定450 nm处的光密度(OD450)。

推荐参考波长在620 nm和690 nm之间。

用100 μL/孔的检测器填充微孔板

抗体工作液(1×)和孵育液

连续振摇0.5小时。

4. 清洗：

取出孔中的内容物并清洗

平板4×，250 μL/孔的清洗缓冲液(1×)。清洗后，倒置平板以倒出孔中的内容物。吸干并在干净的吸水纸上用力敲击，丢弃任何残留液体。

5. 用酶结合物孵育：

向平板中加入100 μL/孔的酶结合物工作溶液(1×)，孵育20 min，期间不断振摇。

6. 清洗：

取出孔中的内容物并清洗

平板4×，250 μL/孔的清洗缓冲液(1×)。清洗后，倒置平板以倒出孔中的内容物。吸干并在干净的吸水纸上用力敲击，丢弃任何残留液体。

计算

计算各标准品、对照品和样品重复OD450值的平均值。借助适当的软件创建标准曲线，好使用四参数或五参数方程的非线性回归模式。根据校准曲线计算的未知样本浓度必须乘以样本的稀释因子。

ELISA性能特征

分析灵敏度

检测限(LOD)定义为可与分析空白区分的低核酸内切酶浓度，经计算约为4 pg/ml。通过计算内切核酸酶浓度测定检测限，该浓度对应于高于分析空白平均OD450三个标准偏差的OD450值。

在对应于三倍LOD的浓度下确认了定量限(LOQ)。LOQ为12 pg/ml。

工作范围

DENARASE ELISA的工作范围定义为32 pg/ml至1000 pg/ml核酸内切酶。

注：基于2018年10月生成的数据。

故障排除

以下列出了分析性能不充分的可能原因。

A.整个平板中无反应性省略孵育步骤或试剂以错误顺序使用试剂ELISA组分制备不充分-

nents/-试剂

C. 整个平板的反应性和/或分析背景过高

不正确的清洗步骤

ELISA组分/试剂的储存或制备不充分

试剂的过度孵育，例如在停止前用底物溶液孵育

D. 批内精密度差（重复的CV过高）

不正确的清洗步骤

标准品、样品和试验对照样品混合不充分

样本制备不当（碎屑）

或样本中的聚集体通过增加不精密度干扰分析性能

B.整个平板反应性差 并应通过离心去除）

ELISA组分/试剂的储存或制备不充分

使用前不允许试剂达到室温

测量光密度的波长不正确

DENARASE是c-LEcta GmbH在欧盟、美国、中国、印度、日本和韩国的注册商标。

*苯并酶核酸内切酶是Merck KGaA的注册商标

订购信息：

DENARASE ELISA试剂盒

 DENARASE ELISA Kit

Article NoDENARASE  41901-1

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