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 技术文章
DENARASE®ELISA试剂盒
点击次数:53 发布时间:2020-12-08

 

DENARASE®ELISA试剂盒

用户说明

DENARASE ELISA试剂盒

ELISA法测定工艺衍生样品中的沙雷菌核酸内切酶。

 

仅供研究和生产使用。

 

将可能含有粘质沙雷氏菌核酸内切酶的样品在预包被有

特异性单克隆捕获抗体以及不同核酸内切酶的标准曲线

 

预期用途

浓度。孵育和清洗后-

 

该ELISA试剂盒预期用于体外定量测定粘质沙雷氏菌核酸内切酶。该检测可用于监测从工艺相关样品中去除核酸内切酶,如DENARASE®或Benzonase*核酸酶,以用于工艺开发和质量控制目的。该试剂盒仅供研究和生产使用,  不  预期用于诊断程序。

 

试验原理

该DENARASE ELISA试剂盒是一种夹心ELISA,在微量检测板形式中进行。

在除去未结合组分的步骤中,加入生物素结合的特异性单克隆检测抗体。进一步洗涤步骤后,结合的检测抗体与作为示踪剂的酶结合物反应。最终清洗步骤后,向孔中加入底物溶液并反应,导致显色。采用光度测定法测量光密度,其与孔中的分析物浓度成正比。可根据相应的DENARASE标准曲线计算未知样品中的核酸内切酶浓度。

 

表1:试剂盒中提供的试剂和材料

No.   试剂 详细信息 数量

 

1 微量检测板(即用型)

96孔(12条/8孔),用粘质沙雷氏菌核酸内切酶特异性单克隆抗体预包被

 

5个微孔板

 

3 稀释缓冲液(10×)

含有表面活性剂和防腐剂的Tris缓冲盐水,10×浓缩液

1 × 20 mL

5 检测抗体(100×)

在含有防腐剂的缓冲溶液中,与生物素结合的粘质沙雷氏菌核酸内切酶特异性单克隆抗体,

100×浓缩液

 

1 × 0.75 mL

 

7 底物溶液 TMB One底物溶液,即用型 1 × 75 mL

 

需要但未随儿童提供的材料和设备

 

 

用于稀释清洗缓冲液和稀释缓冲液的超纯水(至少双蒸水)(以10×浓缩液的形式提供)

用于清除微量测试平板清洗后残留液体的吸水纸巾

用于制备标准品、对照品和样品的适当试管

适用于清洗和稀释缓冲液的容器

适用于有效多通道移液的试剂槽

孵育步骤期间覆盖微量检测板的盖子

定轨微量测定板振荡器(约500 rpm)和涡旋混合器

Microtest洗板机(也可以手动清洗)

精密移液器(可调体积,10 μL至5000 μL),带适当枪头

带适当枪头的多通道移液器(100 μL)

 

试剂的储存

提供的所有试剂均应在2 ℃-10 ℃下冷藏保存,并应在失效日期前使用。

 

 

警告和注意事项

本试剂盒仅供研究和生产使用,仅应使用

由有资质的人员进行。

开始测定前,请仔细阅读说明书。

记录批号和失效日期。请勿混合不同批次的试剂。请勿使用过期试剂。

遵循药物非临床研究质量管理规范和安全性指南。必要时穿戴实验服、一次性手套和防护镜。

试剂制备

使用前将所有试剂和样本恢复至室温。

 

清洗缓冲液的制备(1×)

使用前,用超纯水以10×(2)1:10的比例对清洗缓冲液进行润滑(例如,100 mL 10×浓度溶液与900 mL超纯水混合)。洗涤缓冲液(1×)在室温下可稳定储存长达两周。

 

制备  的  稀释度  缓冲液  (1×)使用前用超纯水以1:10稀释10×浓缩液缓冲液(3)(例如,10 mL 10×浓缩液用90 mL超纯水稀释)。以下

稀释缓冲液(1×)在室温下可稳定储存长达2周。

 

试剂盒中的一些试剂含有Proclin®300 DENARASE标准品的制备

 

作为防腐剂。这些试剂可能引起眼睛和皮肤刺激,应谨慎处理。如果接触眼睛或皮肤,立即用水冲洗。

避光储存底物溶液。

终止液由0.5摩尔硫酸组成。该试剂具有腐蚀性,可能引起眼睛和皮肤刺激。应小心处理。如果接触眼睛或皮肤,立即用水冲洗。

应将剩余的试剂盒试剂和制备的溶液视为具有潜在危害。

符合国家的安全指南和法规的废物。

DENARASE ELISA的标准浓度应在进行测定前即刻使用试剂盒提供的DENARASE标准品(4)制备。标准品应仅在制备当天使用。

 

根据以下稀释方案,在稀释缓冲液(1×)中制备DENARASE ELISA标准品(pdi和S1-S8):

标准品

浓度

抗原体积[μL] 体积稀释

 

ID [pg/ml]μL of

缓冲液[μL]

 

标准品

 

PD:预稀释;S:标准品

 

制备检测抗体工作溶液(1×)

稀释检测抗体100×浓缩液

(5) 用稀释缓冲液(1×)以1:100稀释。对于一个微量检测板,将120 μL 100×浓缩液与12 mL稀释缓冲液混合。该工作溶液应仅在制备当天使用。

 

酶结合物工作溶液的制备(1×)

稀释酶结合物100 x浓缩液

(6) 用稀释缓冲液(1×)以1:100稀释。对于一个微量检测板,将120 μL 100x浓缩液与12 mL稀释缓冲液混合。该工作溶液应仅在制备当天使用。

 

样品制备

应通过离心去除样品中存在的任何聚集体,以确保适当的分析性能。

一般而言,所有样品工作稀释液应仅在制备当天使用。

测定前,应使用稀释缓冲液(1×)稀释样本。最小样品稀释度应为1:2。

 

 

试验程序

所有ELISA步骤均在室温(18 ℃-26 ℃)下进行

使用前,使试剂盒中的所有材料和试剂达到室温。

在达到室温之前,请勿打开预包被微孔板(1)的箔袋。

试验中未使用的剩余平板条应重新装入含干燥剂的袋中。密封袋子,用于冷藏储存。在所有孵育步骤中,平板应盖上盖子(试剂盒未提供),以防止溶液蒸发和污染。

 

1. 培养  其中  标准品   和   样品:用100 μL/孔的DENARASE标准品和试验对照品填充微孔板,作为稀释样品,并在500 rpm下连续振荡孵育1小时。标准品、试验对照品和样品应至少重复分析两次。建议一式三份。

 

2. 清洗:

除去微孔内容物,用250 μL/孔的清洗缓冲液(1×)清洗微孔板4次。清洗后,倒置平板以倒出孔中的内容物。吸干并在干净的吸水纸上用力敲击,丢弃任何残留液体。

 

3. 用检测抗体孵育:

 

7. 用底物溶液孵育并终止:

加入100 μL/孔的底物溶液(7),连续振荡孵育15 min。如果15 min后显色过低,底物孵育时间可延长至30 min。通过直接加入100 μL/孔的终止液(8)终止显色反应,得到黄色产物。

 

8. 测量:

用多通道酶标仪测定450 nm处的光密度(OD450)。

推荐参考波长在620 nm和690 nm之间。

 

用100 μL/孔的检测器填充微孔板

 

抗体工作液(1×)和孵育液

连续振摇0.5小时。

 

4. 清洗:

取出孔中的内容物并清洗

平板4×,250 μL/孔的清洗缓冲液(1×)。清洗后,倒置平板以倒出孔中的内容物。吸干并在干净的吸水纸上用力敲击,丢弃任何残留液体。

 

5. 用酶结合物孵育:

向平板中加入100 μL/孔的酶结合物工作溶液(1×),孵育20 min,期间不断振摇。

 

6. 清洗:

取出孔中的内容物并清洗

平板4×,250 μL/孔的清洗缓冲液(1×)。清洗后,倒置平板以倒出孔中的内容物。吸干并在干净的吸水纸上用力敲击,丢弃任何残留液体。

计算

计算各标准品、对照品和样品重复OD450值的平均值。借助适当的软件创建标准曲线,好使用四参数或五参数方程的非线性回归模式。根据校准曲线计算的未知样本浓度必须乘以样本的稀释因子。

 

 

ELISA性能特征

分析灵敏度

检测限(LOD)定义为可与分析空白区分的低核酸内切酶浓度,经计算约为4 pg/ml。通过计算内切核酸酶浓度测定检测限,该浓度对应于高于分析空白平均OD450三个标准偏差的OD450值。

在对应于三倍LOD的浓度下确认了定量限(LOQ)。LOQ为12 pg/ml。

 

工作范围

DENARASE ELISA的工作范围定义为32 pg/ml至1000 pg/ml核酸内切酶。

注:基于2018年10月生成的数据。

 

故障排除

以下列出了分析性能不充分的可能原因。

 

A.整个平板中无反应性省略孵育步骤或试剂以错误顺序使用试剂ELISA组分制备不充分-

nents/-试剂

 

C. 整个平板的反应性和/或分析背景过高

不正确的清洗步骤

ELISA组分/试剂的储存或制备不充分

试剂的过度孵育,例如在停止前用底物溶液孵育

 

D. 批内精密度差(重复的CV过高)

不正确的清洗步骤

标准品、样品和试验对照样品混合不充分

样本制备不当(碎屑)

或样本中的聚集体通过增加不精密度干扰分析性能

 

B.整个平板反应性差 并应通过离心去除)

ELISA组分/试剂的储存或制备不充分

使用前不允许试剂达到室温

测量光密度的波长不正确

 

 

DENARASE是c-LEcta GmbH在欧盟、美国、中国、印度、日本和韩国的注册商标。

*苯并酶核酸内切酶是Merck KGaA的注册商标

订购信息:

DENARASE ELISA试剂盒

 DENARASE ELISA Kit

Article NoDENARASE  41901-1

Contents according table 1

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