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 技术文章
上海起发INCYTO C-WellTM技术指南
点击次数:115 发布时间:2021-02-24

上海起发INCYTO C-WellTM技术指南

使用INCYTO C-WellTM的通用、高通量和大小可控的细胞球体培养方案

一般信息

本指南的目的:

C-WellTM技术指南包含有关C-WellTM细胞球体培养平台的信息。本指南提供了球体形成和试剂制备的完整方案。

储存和有效期:

室温下储存时,C-WellTM的有效期为36个月。

不要重复使用,否则会遇到以下问题:污染、细胞球体形成失败和富含蛋白质的表面。

请勿将C-WellTM储存在紫外线辐射环境中。

预期用途:

仅供研究使用。不适用于人类或动物的诊断或治疗用途。

 

C孔描述TM

C-WellTM:

C-WellTM是一个革命性的细胞球体培养平台,以高通量的方式生成各种类型的尺寸控制的细胞球体。使用培养细胞球体的技术是一种悬滴法。

每个悬滴中的环境聚集细胞,然后形成单个球体。但悬滴法有几个局限性。悬滴法的主要局限性是:“劳动强度”、“低通量”、“培养时间相对较短”、“无法获得额外的新鲜生长培养基”和“细胞球体大小不均匀”。

与悬滴法相比,C-WellTM具有以下优势

任何其他商业化球体培养平台:“由于易于获得培养基更换,延长培养期10-30天”、“通过控制细胞接种密度,某些应用的培养期极短,为2-3天”、“无直接细胞-细胞接触的共培养准备系统,例如Transwell小室”、“生成尺寸受控的细胞球体”、“由于无剪切应力结构,易于改变装置中的生长培养基”、“适用于各种细胞类型”和“无限通量(一个装置可获得361个细胞球体)”。

 

方法

使用C孔制备用于细胞球体培养的试剂和材料TM

  • 靶细胞生长培养基
  • 胰蛋白酶/EDTA或ACCUTASETM
  • 台盼蓝
  • 磷酸盐缓冲液(PBS)1X
  • 70%乙醇
  • 100%乙醇
  • 去离子水(DDW),可选
  • 牛血清白蛋白(BSA)4%溶液,可选

使用C孔制备细胞球体培养设备TM

  • C-WellTM
  • 锥形管(15 mL或50 mL)
  • T75烧瓶或细胞培养皿
  • 细胞过滤器(100 μm孔径)
  • 皮氏培养皿(60 mm或100 mm,未处理)
  • 血细胞计数器(例如DHC-N01、INCYTO)
  • 移液器和吸头(1 mL和200 μL)
  • 血清移液器及吸头(10 mL)
  • 洁净工作台
  • CO2培养箱
  • 相差显微镜检查
  • 吸引器
  • 离心机
  • 酒精灯

A. C孔预处理TM 细胞接种前

  1. 将生长培养基、1X PBS(或DDW)和100%乙醇加热至室温。

生长培养基的推荐近似体积为14 mL/1器械,1X PBS为24 mL/1器械,100%乙醇为8 mL/1器械。

  1. 在超净工作台中拆除C-WellTM的包装。
  2. 使用无菌镊子,从一个外缘朝向另一个外缘将C-WellTM置于60 mm培养皿上,以防止C-WellTM和培养皿之间产生气泡。
  3. 向制备的平皿中加入8 mL 100%乙醇。
  4. 用1 mL移液器反复移液,轻轻去除微孔中的气泡。
  5. 在培养皿一角抽吸100%乙醇。请勿在每个微孔中抽吸溶液。
  6. 向培养皿中加入8 mL 1X PBS,再次去除气泡。
  7. 在培养皿一角抽吸1X PBS。请勿在每个微孔中抽吸溶液。
  8. 重复上述7、8步两次。
  9. 向培养皿中加入7 mL生长培养基,并充分去除气泡。
  10. 将培养皿置于培养箱中至少24小时。
  11. 用1 mL移液器反复移液,轻轻去除微孔中的气泡。
  12. 在培养皿一角吸出生长培养基,并在细胞接种前加入7 mL新鲜生长培养基。

B-1.靶细胞单细胞悬液的制备(贴壁细胞用)

  1. 将生长培养基和适当浓度的胰蛋白酶/EDTA溶液预热至37 ℃。
  2. 加入10 mL 1X PBS,轻轻清洗细胞培养瓶(T75)或培养皿(100 mm)。
  3. 吸取1X PBS溶液。
  4. 加入2 mL胰蛋白酶/EDTA溶液,并将烧瓶置于37℃CO2培养箱中1 ~ 2 min(取决于细胞类型)。
  5. 轻轻敲击烧瓶,观察细胞。大部分细胞应分离
  6. 用4 mL生长培养基或适当的中和溶液中和胰蛋白酶/EDTA处理的细胞悬液。
  7. 通过反复移液彻底分离细胞。
  8. 用血细胞计数器计数细胞数量(例如INCYTO C-Chip、DHC-N01)
  9. 在适当离心力下离心细胞悬液。
  10. 通过抽吸去除上清液。
  11. 将细胞团块重悬于生长培养基中。细胞悬液的终接种密度和终体积应分别为0.1 ~ 0.5 × 106个/mL和7 mL。这些值因细胞类型而异。

 

B-2.靶细胞单细胞悬液的制备(用于悬浮细胞)

  1. 将生长培养基和适当浓度的胰蛋白酶/EDTA溶液(可选)加热至37 ℃。
  2. 通过反复移液使细胞悬液均质化并解聚。
  3. 用血细胞计数器计数细胞数量(例如INCYTO C-Chip、DHC-N01)
  4. 在适当离心力下离心细胞悬液。
  5. 通过抽吸去除上清液。
  6. (可选)加入1 ~ 2 mL胰蛋白酶/EDTA溶液,置于37 °C CO2培养箱中1 ~ 2 min(细胞类型不同)。
  7. (可选)用2 ~ 4 mL生长培养基或适当的中和溶液中和胰蛋白酶/EDTA处理的细胞悬液(因细胞类型而异)。
  8. (可选)在适当离心力下离心细胞悬液。
  9. (可选)通过抽吸去除上清液。
  10. 将细胞团块重悬于生长培养基中。细胞悬液的终接种密度和终体积应分别为0.1 ~ 0.5 × 106个/mL和7 mL。这些值因细胞类型而异。

 

  1. 使用C-Well形成细胞球体TM
    1. 将生长培养基加热至37 ℃。
    2. 用1 mL移液器反复移液,轻轻去除微孔中的气泡。
    3. 吸出培养皿一角的生长培养基,加入7 mL细胞接种密度为0.1 ~ 0.5 × 106个/mL的细胞悬液
    4. 10 ~ 15 min后(因细胞类型而异),轻轻吸出细胞悬液,除去上清液细胞。
    5. 在培养皿一角加入7 mL生长培养基。
    6. 吸出混悬液,并在培养皿一角加入7 mL生长培养基。重复该步骤两次。确保该步骤结束时没有悬浮细胞是非常重要的。如果不是,这些悬浮细胞可能阻碍细胞球体的形成。
    7. 培养皿置37 °C CO2培养箱中孵育24小时。
    8. 每24小时更换一次培养皿中的生长培养基。
 
 

图1 MCF7球体的培养条件。细胞接种密度和清洗时间因细胞类型而异。应通过预实验确定适当的接种密度和洗涤时间。


 

 

图2 MCF7球体的形成。

 

 

 

图3 A549球体的形成。

 

 

图4 HepG2球体的形成。

 

 

图5小鼠神经干细胞(mNSC)球体的形成。与其他传统的球体培养方法相比,C-WellTM可以生成尺寸控制、形状均匀的细胞球体。

  1. 从C孔中分离细胞球体TM
    1. 将生长培养基加热至37 ℃。
    2. 用移液器直接吸取(带1 mL吸头)生长培养基至C-WellTM上。
    3. 重复上述步骤2,直至收集到大部分细胞球体。
    4. 轻轻移取细胞球体溶液。
    5. 将溶液添加到细胞过滤器的一个表面(顶部)。
    6. 翻转滤网,并将生长培养基添加到滤网的另一面(底部)。
    7. 将细胞球体铺板于未经处理的培养皿中。
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