磷酸化特异性抗体的发明*改变了我们研究蛋白质功能的方式

由 Mike Browning 和 Amy Archuleta 提供

对于蛋白质，形成 IS 函数。

蛋白质做它们做的事是因为它们的形状。结构蛋白不断发挥作用以支撑细胞结构。其他蛋白质介导的生物功能（例如细胞分裂）必须根据细胞需要进行调节和关闭。蛋白质磷酸化是调节蛋白质结构及其活性的主要细胞机制。当蛋白激酶将磷酸从 ATP 转移到目标蛋白上的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基时，就会发生蛋白磷酸化。添加带负电荷的磷酸基团会改变目标蛋白质的形状，从而改变其功能。

磷蛋白被认为是体内最重要的蛋白质之一。

磷蛋白是调节几乎所有细胞过程的蛋白质，从癌症中的细胞分裂到学习和记忆中的神经元信号转导。由于磷蛋白几乎调节所有重要的细胞功能，我们喜欢说“磷蛋白是蛋白质组学语言的动词”。分析特定蛋白质磷酸化状态的能力对于确定给定蛋白质的功能以及该活性如何受细胞信号影响的探索非常有用。此类检测对于鉴定可影响磷酸化并因此影响特定蛋白质功能的药物也至关重要。

需要一种方法来跟踪蛋白质的活性，而不仅仅是其表达水平。

为了形象化这种工具的重要性，想象一个 FBI 特工坐在车里监视房子里的嫌疑R。特工可能无法看到嫌疑R在哪个房间或他们在做什么。将其与房屋内装有摄像机的代理进行对比。同样，磷酸化特异性抗体不仅表明存在蛋白质，还表明蛋白质是否具有活性。

磷蛋白检测的历史始于放射性。

不幸的是，在早期研究中可视化磷蛋白需要用32 P对磷酸基团进行放射性标记。 这是劳动密集型的：实际上有数千种蛋白质被磷酸化（并结合32 P），因此需要免疫沉淀将感兴趣的蛋白质与所有其他标记的蛋白质分开蛋白质。然而，即使进行免疫沉淀并分离出感兴趣的蛋白质，也无法确定蛋白质上的哪个位点已被磷酸化。这是至关重要的，因为蛋白质上的某些位点可以打开它，而其他位点可以关闭它。此外，32 P 研究很难量化，因为仅代谢变化就可以改变32P 级别的标记。最后，由于无法在体内用32 P标记，体内磷酸化的研究实际上是不可能的。

几十年前，磷酸化特异性抗体的开发始于针对磷酸酪氨酸的抗体。

产生磷酸化依赖性抗体的第一份报告出现在 1981 年，当时通过将膦酸苄酯注射到兔子体内产生了可以检测含磷酸酪氨酸蛋白的抗体 (1)。这些抗体成为癌症研究的关键试剂，但在许多蛋白质上检测到磷酸酪氨酸。此类抗体的主要缺点不仅在于它们检测许多不同蛋白质的磷酸化，而且与32P 研究，他们经常检测同一蛋白质上的多个磷酸化位点。本质上，此类抗体显示磷酸化正在发生，但无法识别哪些蛋白质以及蛋白质上的哪些位点被磷酸化。还进行了许多尝试以产生检测磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸的抗体，但这些方法大体上不是很成功。

使用全长蛋白质作为抗原更有针对性，但仍然存在问题。

在这项初步工作后不久，Nairn 及其同事描述了一种特异性针对 G 底物磷酸化形式的抗体的产生，G 底物是一种定位于小脑浦肯野细胞并被 cGMP 依赖性蛋白激酶磷酸化的蛋白质 (2)。该抗体是通过体外磷酸化的纯化G-底物磷蛋白对家兔进行免疫接种而制备的。. 尽管取得了初步成功，但通过用完整蛋白质的磷酸形式免疫来生产磷酸特异性抗血清的其他尝试并不十分成功，这可能是因为两个重要因素。首先，据信许多磷酸化蛋白质在免疫过程中会快速去磷酸化，无论注射途径如何，都会导致所需磷酸化表位的丢失。其次，全蛋白通常含有多个免疫原性表位。由于磷酸位点只是这种长蛋白质的一小段，因此针对全长蛋白质抗原的抗体识别感兴趣的磷酸位点的可能性很低。

生成位点特异性磷酸化抗体的更直接方法是利用合成肽的磷酸化形式。

由紧邻感兴趣的磷酸化氨基酸周围的 15-20 个氨基酸组成的短肽将免疫反应集中在特定磷酸位点上。此外，这些短肽通常对去磷酸化具有抗性。然而，这不是绝对的，因为某些肽确实会去磷酸化。这也导致产生针对非磷酸化肽的抗体。因此，必须纯化这些肽免疫后收集的血清，以将磷酸肽抗体与识别 dephopsho 肽的抗体分离。

磷酸化和去磷酸化肽在磷酸化特异性抗体的纯化中非常有用。

我们的一位联合创始人：Andy Czernik 和他的同事 (3) 制定了生产磷酸化状态特异性抗体的通用方案。通过连续层析，首先通过将血清通过与用作抗原的磷酸化肽结合的柱子，从去磷酸化抗体中积极地选择磷酸化抗体。此步骤之后是在与去磷酸化形式的肽结合的柱上进行负选择。可以在我们的网站上找到此纯化程序的详细信息。

今天的磷酸化特异性抗体仅在蛋白质处于磷酸化状态时与目标蛋白质结合。

通过这种革命性免疫化学技术的发展，现在可以开发磷酸化特异性抗体，用于确定特定蛋白质上特定位点的磷酸化水平。它们更容易使用，因为抗体只标记感兴趣的蛋白质。IP 不需要分离其他蛋白质，也不需要使用32 P 标记。因此，抗体可用于 WB 和 IHC，以显示目标蛋白特定位点磷酸化的相对强度。此外，当该抗体用于 IHC 时，可以识别其中蛋白质已被激活的特定细胞。我们将在我们的博客中讨论在 IHC 中使用磷酸化特异性抗体。

对磷蛋白功能的了解导致了癌症治疗的巨大进步。

磷酸化特异性抗体*改变了蛋白质磷酸化的研究，并帮助了许多针对磷蛋白治疗疾病状态的新药的开发。影响磷酸化的药物在癌症治疗中得到*泛的应用和研究。最常见的磷酸化相关药物是小分子激酶抑制剂。此类抑制剂占当前药物发现和开发工作的近四分之一。抑制不同的激酶信号通路对非癌细胞的细胞毒性较小，从而影响对癌细胞的选择性杀伤，毒性较小 (4)。

超越蛋白质印迹：IHC 和 IF 的未开发机会。

磷酸化特异性抗体广泛用于磷酸化蛋白的蛋白质印迹分析。然而，在免疫组织化学的奇妙世界中，这些抗体的使用却少得多。鉴于此类研究可以提供有关磷蛋白的细胞和亚细胞定位的明显细节，因此缺乏使用 IHC/IF 的研究是不幸的。在 PhosphoSolutions，我们竭尽全力验证我们的许多 IHC/IF 磷酸化抗体。此外，我们还写了一章讨论这些抗体在 IHC/IF 中的使用。在随后的博客中，我们将讨论在 IHC/IF 中使用磷酸化抗体的最佳实践。

来自我们创始人 Mike Browning 的最后个人笔记

多年前我开始读研究生时，只知道 2 种蛋白激酶。今天我们知道人类基因组编码超过 500 种激酶。尽管如此，发现这个迷人的世界还是非常令人兴奋的，在这个世界中，蛋白质可以像灯泡一样被关闭和重新打开。当我得知这个过程时，就像一个灯泡在我脑海中闪过。我正在研究脑细胞信号的可塑性方式，即它可以打开和关闭，甚至可以像立体声音响上的音量控制一样上下。就在我面前的是支持大脑可塑性的分子机制：塑料蛋白！我被迷住了，从那以后一直如此。谢天谢地，有磷酸抗体，否则我现在可能会对32 P产生放射性。