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KOD-Plus-Neo产品说明书

更新时间:2023-11-17      点击次数:924

        KOD-Plus-Neo是基于一种ji端嗜热的海洋古生菌Thermococcus kodakarensisDNA聚合酶。这种聚合酶由于其高效的3’-5核酸外切酶活性(校对活性)。该产品含有一种du特的延伸增强剂",可抑制传统PCR产生的平台效应"。因此,与先前版本的KOD-PlusKOD-201)相比,该试剂表现出更高的扩增效率和延伸能力。此外,这种酶对于PCR延伸步骤仅需要30/kb。这有利于长片段PCR。这种酶含有两种抑制聚合酶3’-5’核酸外切酶活性的抗KOD DNA聚合酶抗体和,从而支持热启动PCR

产品特点

Ø 普通Taq DNA聚合酶高80倍的PCR保真度

Ø 与传统PCR相比,延伸增强剂"能够实现更高的扩增效率和延伸能力

1.png

Ø PCR延伸步骤只需要30/kb

Ø 两步循环条件可用于使用≥20 mer引物的扩增(退火温度,Tm>63°C)。

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产品组分

KOD -Plus- Neo (1.0 U/μL)*

200 μL×1

10 x PCR Buffer for KOD -Plus-Neo

1 mL×1

25 mM MgSO4

1 mL×1

2 mM dNTPs

1 mL×1

 

引物设计

Ø 引物应为22-35个碱基,Tm>63

Ø 引物的最佳GC含量为45-60%53的理想GC含量分别为60-70%40-50%

Ø 片段扩增的引物应为25-35个碱基,Tm>65°C

Ø 不能使用含有肌苷的引物

Ø 建议使用最近邻法计算引物的Tm。本手册中的Tm值是使用以下参数使用该方法计算的。Na+浓度:50 mM 寡核苷酸浓度:0.5 µM

 

PCR产物的克隆

Ø KOD-Plus-Neo由于其3-5核酸外切酶活性。因此,PCR产物为平端产物,可以根据平端克隆方法进行克隆。

Ø KOD-Plus-NeoPCR产物应在限制性内切酶处理之前进行纯化。KOD DNA聚合酶的5-3核酸外切酶活性在PCR反应结束时仍然存在。

Ø 克隆KOD DNA聚合酶产生的PCR产物推荐专用TA克隆试剂盒“TArget clone™ -Plus- (Code No. TAK-201)"

实验步骤

1. 标准反应体系配置

反应物准备前,除酶溶液外,所有成分均应wan全解冻。

组分

体积

终浓度

10x Buffer for KOD -Plus- Neo

5 μL

1x

2 mM dNTPs

5 μL

0.2 mM each

25 mM MgSO4

3 μL

1.5 mM

10 pmol/μL Primer #1

0.75–1.5 μL

0.15–0.3 µM

10 pmol/μL Primer #2

0.75–1.5 μL

0.15–0.3 µM

Template DNA

X μL

Genomic DNA ≤ 200 ng/50 μL

Plasmid DNA ≤ 50 ng/50 μL

cDNA ≤ 200 ngRNA equiv.)/50 μL

PCR grade water

Y μL


KOD -Plus- Neo (1.0 U/μL)

1 μL

1.0 U/50 μL

总体积

50 μL


**不要使用其它试剂盒或其它公司的dNTP

注意:

最佳引物浓度为0.3 µM。在长片段(≥10kb)的情况下,降低引物浓度(0.15µM)可能会产生更有效的扩增。

二甲基亚砜DMSO(终浓度2-5%)的添加有利于扩增富含GC的靶标。在DMSO存在的情况下,PCR保真度不会降低(参见步骤2,循环条件)。

cDNA或基因组DNA中的污染RNA通过螯合Mg2+来抑制PCR反应。应使用<200 ng RNA的模板DNA进行PCR

模板DNA的质量应通过电泳检查。模板DNA的长度和纯度影响扩增结果

含有尿嘧啶的模板不能用于扩增。

对于PCR反应,建议使用薄壁管。建议总反应体积为50 μL

2. 循环条件

推荐≥20 mer引物,Tm>63°C的两步循环条件用于有效扩增。

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两步循环

如果引物Tm值超过63°C,建议采用两步循环。

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注意:

对于使用低拷贝模板的扩增或长片段(>10kb)的扩增,更长的延伸时间(高达1 min/kb)或更高的Mg2+浓度(高达2 mM终浓度)可以提高产率。

二甲基亚砜DMSO(终浓度2-5%)的添加可能有利于扩增富含GC的片段。所用DMSO的浓度应根据引物的Tm来确定。

<25 mer or Tm <68: 2%

25 mer or Tm 68: 5%

如果扩增失败,可能需要3步循环

步循环

当引物的Tm小于63℃时,应使用三步循环。

5.jpg 

注意:

对于使用低拷贝模板的扩增或长片段(>10kb)的扩增,更长的延伸时间(高达1 min/kb)或更高的Mg2+浓度(高达2 mM终浓度)可以提高产率。

二甲基亚砜DMSO(终浓度2-5%)的添加可能有利于扩增富含GC的片段。

降落PCR

如果在2步和3步循环条件下观察到非特异性扩增(在PCR产物电泳后观察到额外的条带),降落PCR可以提高特异性。

6.jpg 

注意:

对于使用低拷贝模板的扩增或长片段(>10kb)的扩增,更长的延伸时间(高达1 min/kb)或更高的Mg2+浓度(高达2 mM终浓度)可以提高产率。

二甲基亚砜DMSO(终浓度2-5%)的添加可能有利于扩增富含GC的片段。所用DMSO的浓度应根据引物的Tm来确定。

<25 mer or Tm <68: 2%

25 mer or Tm 68: 5%

 

应用实例

性能数据:

1. PCR保真度

TArget克隆技术对从人基因组DNA中扩增的人β-珠蛋白基因产物进行序列分析,测定突变频率KOD-Plus-Neo表现出ji好的保真度,突变频率与以前版本的酶(KOD-Plus-)相同。

7.png 

2. 延伸能力

根据每种酶的推荐条件,通过几种PCR酶从人类基因组DNA中扩增出各种大小的片段KOD-Plus-Neo成功扩增了17.5 kb片段

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3. 低拷贝模板扩增

使用0.5 ng cDNA模板扩增四个基因。模板由HeLa细胞的总RNA合成。KOD-Plus-Neo成功扩增了所有基因。

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4. 延伸速度

不同的扩增时间从人类基因组DNA50ng)中扩增β-珠蛋白基因(3.6 kb)。KOD-Plus-Neo可以用30/kb的延长时间扩增3.6 kb的靶标。

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应用数据:

1. 各种蛋白激酶片段的扩增

利用HeLa细胞总RNA合成的cDNA扩增各种蛋白激酶开放阅读框。KOD-Plus-Neo成功扩增了所有片段。

 

2. 长片段扩增

使用不同浓度的引物从人类基因组DNA中扩增长片段。过多的引物会抑制扩增。因此,应使用约0.15 µM的较低引物浓度扩增长片段(>10 kb)。

12.jpg 

常见问题及解决办法

问题

可能的原因

解决办法

无产物或低产量

循环条件不合适

使用三步循环,将退火温度逐渐降低至最大Tm-5–10°C

延伸时间延长至1分钟/kb

将循环次数增加2-5个循环

Mg2+浓度低

Mg2+浓度增加至2 mM

目标序列GC含量高

加入25%DMSO

引物的质量和/浓度问题

引物浓度逐步降低至0.15 µM

使用新的引物

重新设计引物

模板DNA的质量和/浓度问题

检查模板DNA的质量

增加模板DNA浓度

酶浓度低

将酶浓度提高至1.5–2.0 U/50 μL

弥散条带或杂带

循环条件不合适

将循环次数减少2-5个循环

3步循环更改2步循环

2步循环更改降落PCR

引物的质量问题

使用新的引物

重新设计引物

模板DNA太多

减少模板DNA浓度

Mg2+浓度太高

MgSO4逐步降低至1.0 mM

酶浓度太高

将酶浓度降至0.50.8 U/50 μL

TA克隆效率差

PCR产物具有平末端

使用专用TA克隆试剂盒TArget clone-Plus-(Code No. TAK-201)

 

参考文献

1) Takagi M, Nishioka M, Kakihara H, Kitabayashi M, Inoue H, Kawakami B, Oka M, and Imanaka T., Appl Environ Microbiol., 63: 4504-10 (1997).

2) Hashimoto H, Nishioka M, Fujiwara S, Takagi M, Imanaka T, Inoue T and Kai Y, J Mol Biol., 306: 469-77 (2001).

3) Mizuguchi H, Nakatsuji M, Fujiwara S, Takagi M and Imanaka T, J Biochem., 126: 762-8 (1999).

4) Fujii S, Akiyama M, Aoki K, Sugaya Y, Higuchi K, Hiraoka M, Miki Y, Saitoh N, Yoshiyama K, Ihara K, Seki M, Ohtsubo E and Maki H, J. Mol. Biol., 289: 835-850 (1999).

 

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货号

产品名称

规格

品牌

KOD-401

KOD -Plus- Neo

200 reactions

TOYOBO

 

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产品名称

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