一个抗体做IHC染色，如果不出效果，可能是哪些因素造成的？

一个抗体在免疫组化（IHC）实验中不出效果（即无信号或信号弱）是一个非常常见的问题。这通常是由一整套复杂的因素共同导致的，需要进行系统性的排查。

以下是可能导致IHC染色失败的常见原因，可以按照这个思路进行排查： 

一、 样本相关问题

1.  固定不当：

●固定不及时：组织离体后未及时固定，导致抗原降解（内部蛋白酶分解）或弥散。

●固定时间过长或过短：

- 过短：固定不充分，抗原保存不佳。

- 过长：过度交联会遮蔽抗原表位，尤其是甲醛固定，导致抗原无法被抗体识别。这种情况非常常见。

●固定剂不匹配：常用的是10%中性福尔林，但某些特定抗原可能需要特殊的固定液（如丙酮、乙醇等）。

2.  包埋与切片：

●烤片温度过高或时间过长：会破坏抗原。

●切片厚度：切片太厚可能导致抗体渗透不佳，背景加深；太薄可能导致目标抗原量不足。

3.  内源性干扰物质：

●内源性过氧化物酶：在肝脏、肾脏等富含血细胞的组织中，未全部灭活的内源性过氧化物酶会导致背景染色，掩盖特异性信号。

●内源性生物素：在某些组织（如肝、肾、脑）中含量高，如果使用生物素检测系统，会产生严重的非特异性背景。

4.  抗原修复不当（这是最常见的原因之一）

●未进行抗原修复：对于福尔林固定石蜡包埋的组织，绝大多数抗原都被交联遮蔽，必须进行抗原修复。

●修复方法选择错误：

- 热修复法：包括高压法、微波法、水浴法。适用于大多数抗原。

- 酶修复法：如胰蛋白酶、胃蛋白酶。适用于特定抗原。

- 选择错误的修复方法或修复液（如该用EDTA修复液却用了枸橼酸盐修复液）可能导致修复效果不佳。

●修复条件不佳：修复时间、温度、pH值不准确。修复不足会导致信号弱；修复过度可能导致背景染色或组织脱片。

 二、 抗体相关问题

1.  抗体选择不当：

●抗体特异性：抗体并非为其应用（IHC）而验证。务必查阅说明书，确认该抗体已验证可用于IHC，特别是您所用的物种和组织类型（如：人、小鼠、大鼠；石蜡切片/冰冻切片）。

●抗体克隆号：不同克隆号识别同一蛋白的不同表位，其IHC效果可能差异巨大。

2.  抗体保存与使用：

●抗体失效：抗体反复冻融、存放温度不当或超过有效期导致失活。

●稀释度不当：

- 浓度过低：信号弱或无信号。

- 浓度过高：可能导致非特异性结合，背景高，信噪比差。

●孵育条件：孵育时间不足或温度过低，抗体未能充分与抗原结合。

 三、 实验操作与试剂问题

1.  检测系统问题：

●检测试剂盒失效：HRP或AP酶失活，或显色底物失效（例如DAB/AEC沉淀）。

●系统不匹配：使用了一抗种属不匹配的二抗（如兔来源的一抗用了抗小鼠的二抗）。

●步骤遗漏或错误：例如忘了加二抗，或忘了加显色底物。

2.  封闭问题：

●封闭不充分：导致非特异性背景高，可能掩盖弱阳性信号。

●封闭剂选择不当：常用5% BSA或与二抗同源的非免疫血清。如果使用生物素系统，需要额外进行内源性生物素封闭。

3.  洗涤问题：

●洗涤不充分：残留的抗体或试剂会导致高背景。

●洗涤过度：可能会洗掉特异性结合的一抗/二抗。

4.  显色与复染：

●显色时间过短：信号未充分显现。

●显色时间过长：背景过高，甚至出现假阳性。

●复染过深：掩盖了弱阳性信号。

 四、 对照设置问题

没有设置正确的对照，就无法判断问题是出在样本、抗体还是操作上。

●阳性对照：使用已知表达该靶抗原的组织。如果阳性对照也无染色，说明整个实验系统有问题。

●阴性对照：

- 空白对照：只用PBS或抗体稀释液代替一抗。如果此对照有染色，说明存在非特异性背景。

- 同型对照：使用与一抗同种属、同亚型的无关免疫球蛋白。用于排除抗体的Fc段非特异性结合。

五、系统性排查建议（故障排除流程）

当遇到无信号时，建议按以下步骤排查：

1.  确认阳性对照：您的阳性对照组织染色是否正常？

●是 → 问题很可能在您的“待测样本"本身（抗原不表达或含量极低）或“样本处理"（固定、包埋）上。

●否 → 问题出在“实验流程或试剂"上。

2.  检查阴性对照：您的阴性对照（无一抗）是否有染色？

●是 → 存在“高背景"。检查：内源性酶是否全部灭活？封闭是否充分？抗体浓度是否过高？洗涤是否充分？

●否 → 背景干净，但无信号，进入下一步。

3.  回顾实验流程：

●抗原修复：这是石蜡切片的首要排查点。尝试更换修复方法（如从枸橼酸盐换为EDTA）或优化修复条件（时间、温度）。

●抗体：重新查阅说明书，确认稀释比、孵育时间和条件。使用更新鲜的抗体或新批次抗体进行测试。

●检测系统：确认所有试剂（特别是二抗和DAB）均在有效期内，且正确配制。尝试使用敏感性更高的检测系统（如聚合物法）。

4.  最终验证：

●如果条件允许，可以使用“Western Blot"验证该样本中是否存在目标蛋白。

●尝试使用另一种“已验证有效的、不同克隆号"的抗体来检测同一靶点。

六、总结

总之，IHC是一个多步骤的复杂实验，需要精细的操作和系统性的优化。从样本处理开始，每一步都可能成为成败的关键。

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