德国emfret生物公司血管相关研究用抗体技术方案解析

一、技术方案

•小鼠血小板表面糖蛋白的流式细胞术分析

•免疫组织化学（采用丙酮固定的冰冻切片）

•免疫沉淀

•免疫印迹（蛋白质印迹分析）

二、小鼠血小板表面糖蛋白的流式细胞术分析

（1）缓冲液和试剂

•Tris 缓冲盐水 / 肝素（TBS/Hep）：20 mM Tris/HCl；137 mM NaCl；pH 7.3；含 20 U/ml 肝素。

•磷酸盐缓冲盐水（PBS）：137 mM NaCl；2.7 mM KCl；1.5 mM KH₂PO₄；8 mM Na₂HPO₄；pH 7.14。

•Tyrode's 缓冲液（改良型）：134 mM NaCl；0.34 mM Na₂HPO₄；2.9 mM KCl；12 mM NaHCO₃；20 mM Hepes；pH 7.0；5 mM 葡萄糖；0.35%（w/v）牛血清白蛋白。

•腺苷三磷酸双磷酸酶（Apyrase）：10 U/ml 储备液（溶于双蒸水，-20℃保存）。

•前列环素（前列腺素 I₂，PGI₂）：1 mM 储备液（溶于双蒸水，-20℃保存）。

•CaCl₂：1 M 储备液（溶于双蒸水）。

（2）稀释或洗涤全血的制备

1.用肝素化玻璃毛细管（如 ringcap）从眼眶后丛采集 50ul 血液，加入含 200ul TBS / 肝素（20 U/ml）的 1.5 ml 试管中。

2.用 1 ml Tyrode's 缓冲液稀释，用于流式细胞术分析。

3.若要制备 “洗涤过的血液"：将稀释血液以 900×g离心 5 分钟，弃上清，将沉淀重悬于 1.25 ml Tyrode's 缓冲液中。

4.实验开始前，直接加入 1 mM CaCl₂。

注意：对于凝血酶诱导的血小板活化，需去除血浆以避免抗凝血酶活性的干扰。

（3）洗涤小鼠血小板的制备

“洗涤血小板" 的制备耗时更长，但需要更多血液，且所得血小板制品可使用数小时。

1.用 1.5 cm 玻璃毛细管从眼眶后丛采集 0.5–1 ml 血液，加入含 200ul TBS / 肝素（20 U/ml）的 1.5 ml 试管中。

2.样本以 500×g离心 5 分钟，将 ** 富含血小板的血浆（PRP）** 转移至新试管（为回收血小板，需取包含所有红细胞的完整白色层）。

3.将血小板悬液以 300×g离心 8 分钟，将无红细胞的 PRP 转移至新试管。

4.加入 0.5uM 前列环素（PGI₂），以 1300×g离心 5 分钟。

5.将血小板沉淀重悬于 1 ml Tyrode's 缓冲液，加入 0.02 U/ml 腺苷三磷酸双磷酸酶和 0.5uM 前列环素，37℃孵育 5 分钟后，以 1300×g离心。

6.重复步骤 5：将血小板沉淀重悬于 0.5 ml Tyrode's 缓冲液，加入 0.02 U/ml 腺苷三磷酸双磷酸酶，37℃孵育 30 分钟。

（4）血小板表面糖蛋白的单色分析

1.将 5ul特异性抗体或阴性对照抗体与 25ul “稀释全血" 或 “洗涤过的血液" 加入测定管，涡旋振荡 1–2 秒。

2.室温孵育 15 分钟。

3.加入 400ul PBS 终止反应，并在 30 分钟内完成分析。

（图示说明：样本按上述方法与 FITC 偶联的对照 IgG（黑线）、抗 - GPVI 或抗 - GPV 孵育。通过 “ 前向散射（FSC）/ 侧向散射（SSC）特征对血小板设门；设门（R1）血小板的荧光 1（FL1）"强度在单独直方图中显示。RBC：红细胞。）

（5）血小板活化的双色分析

1.向测定管中加入 5ul特异性抗体或阴性对照抗体，同时加入 5ul泛血小板标志物。

2.此时可加入小体积（<5ul）额外试剂（如抑制剂）。

3.加入 25ul “稀释全血"“洗涤过的血液" 或 “洗涤过的血小板（1×10⁶个）"，涡旋振荡 1–2 秒。

4.室温孵育 15 分钟；加入 400ul PBS 终止反应，并在 30 分钟内完成分析。

（图示说明：洗涤后的小鼠血小板与 PBS（静息组）或凝血酶（0.1 U/ml），以及 FITC 和 PE 偶联的单克隆抗体（mAbs）共同孵育。通过GPIX 或 GPIIbIIIa 的表达对血小板设门（FL1；gate 1）。）

三、免疫组织化学（采用丙酮固定的冰冻切片）

请注意：不建议对（多）聚甲醛固定的样本进行免疫染色 —— 因为大多数大鼠抗体在小鼠组织上的染色效果较差。

1.将冰冻组织切片贴于载玻片，4℃下用冰冷的 100% 丙酮固定 20 分钟；室温下干燥样本过夜。

2.为减少试剂用量，可用防水笔在载玻片的组织切片周围画 “疏水环"；后续所有步骤中，该环内区域不得干燥，因此建议在湿盒中进行孵育。

3.切片在 PBS 中孵育 20 分钟。

4.若使用过氧化物酶偶联的二抗：将切片与 0.03% H₂O₂在室温下孵育 10 分钟（抑制内源性过氧化物酶活性），再用 PBS 冲洗切片 3 次（每次 5 分钟）。

5.切片在封闭液（二抗宿主物种的血清，用 PBS 按 1:10 或 1:100 稀释）中室温孵育 1 小时。

6.用封闭液稀释的一抗（2–10ug/ml）覆盖切片，室温孵育 2 小时。

7.用 PBS 冲洗切片 3 次（每次 5 分钟）。

8.用荧光团偶联或过氧化物酶偶联的二抗（如亲和纯化的驴抗大鼠 IgG-FITC 或 - HRP，按制造商说明用封闭液稀释）覆盖切片，室温孵育 1 小时。

9.吸去多余液体，用 PBS 冲洗 3 次（每次 5 分钟）。

10.a）荧光染色的样本可直接用荧光显微镜分析。

11.b）若要显示 “过氧化物酶标记的结构"：用新鲜制备的3 - 氨基 - 9 - 乙基咔唑（AEC）底物覆盖切片，孵育至显微镜下可见红色染色（时间 5–30 分钟不等）；在出现橙色背景染色前，用去离子水冲洗终止反应。如需复染，将样本与苏木精孵育 30–240 秒，再用流动温水冲洗切片 20 分钟；最后用水性包埋液封片。

四、免疫沉淀

（1）缓冲液和试剂

•PBS/EDTA：137 mM NaCl，2.7 mM KCl，1.5 mM KH₂PO₄，8.0 mM Na₂HPO₄・2H₂O，pH 7.3；含 5 mM EDTA。

•IP 缓冲液：40 mM Tris/HCl，0.3 M NaCl，1 mM EDTA，2 mM PMSF，10ug/ml 亮抑酶肽，10ug/ml 抑肽酶，1ug/ml 胃蛋白酶抑制剂。

•Igepal：10% 储备液（溶于双蒸水）。

•2×SDS - 样本缓冲液：10%β- 巯基乙醇（用于还原缓冲液），10% Tris 缓冲液（1.25 M），20% 甘油，4% SDS，0.02% 溴酚蓝。

（2）操作步骤

1.洗涤小鼠血小板或细胞（每次免疫沉淀用 1×10⁷个）3 次：每次用 1 ml PBS/EDTA，5 分钟，1300×g；然后重悬于 IP 缓冲液。

2.加入 1% Igepal，室温裂解血小板 15–20 分钟。

3.以 10,000×g离心 5 分钟去除细胞碎片，将上清液转移至新管。

4.加入 20ul“ 洗涤过的蛋白 G 琼脂糖（PGA）" 进行 “预清除"，4℃孵育至少 3 小时。

5.样本以 3,000×g离心 5 分钟；将上清液转移至新管，加入 “数据表指定浓度的抗体"（通常 2–5ug/ml），30 分钟后加入 25ul 洗涤过的 PGA；4℃下旋转孵育至少 2 小时（最好过夜）。

6.洗涤沉淀物：样本以 3,000×g离心 1 分钟；向 PGA 沉淀中加入 1 ml 含 1% Igepal 的 1×IP 缓冲液，再以 3,000×g离心 1 分钟。

7.用 plain IP 缓冲液洗涤 PGA 沉淀 2 次（每次 1 分钟，3,000×g）。

8.将沉淀重悬于 25ul 1×SDS 样本缓冲液（还原或非还原型），煮沸 5 分钟；样本可冷冻（-20℃）备用，或用于 SDS-PAGE 及后续免疫印迹分析。

五、免疫印迹（蛋白质印迹分析）

（1）缓冲液和试剂

•裂解缓冲液：40 mM Tris/HCl，0.3 M NaCl，1 mM EDTA，0.05% NaN₃，1% Igepal。

•PBS：137 mM NaCl，2.7 mM KCl，1.5 mM KH₂PO₄，8.0 mM Na₂HPO₄·2H₂O，pH 7.3。

•PBS-5% 牛奶：含 5% 非脂干奶的 PBS。

•PBST：含 0.1% Tween 20 的 PBS。

•PBST-1% 牛奶：含 1% 非脂干奶的 PBST。

（2）操作步骤（所有步骤可在室温下进行）

1.用裂解缓冲液制备小鼠血小板或细胞的裂解物，与（2×）SDS 样本缓冲液在 95℃孵育 5 分钟。

2.通过 "SDS - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）"分离蛋白质（还原或非还原条件，依数据表说明），然后将蛋白质转移至 PVDF 膜。

3.用 PBS-5% 牛奶封闭膜，振荡孵育1 小时。

4.用含 2–5ug/ml 一抗的 PBST-1% 牛奶孵育膜，振荡 1 小时。

5.用 PBST 冲洗膜 2 次，再用 PBST 洗涤 2 次（每次 30 分钟）；洗涤程序可简化为 “每次 10 分钟，共 3 次"，但需单独验证。

6.用含 HRP 偶联抗大鼠 IgG 的 PBST-1% 牛奶孵育膜，振荡 45–60 分钟。

7.用 PBST 冲洗膜 2 次，再用 PBST 洗涤 2 次（每次 30 分钟）。

8.用 "ECL（增强化学发光）"显示结合的抗体。

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（注：本文内容基于品牌公开资料及行业常规信息整理，具体以品牌信息文档为准。）