人E3泛素蛋白连接酶RNF128酶联免疫吸附测定试剂盒使用说明书

基本参数

品牌：Abbexa

产品编号：abx542962

规格：96孔

检测范围：0.156纳克/毫升 ●10纳克/毫升

灵敏度：＜0.06纳克/毫升

储存条件：洗涤缓冲液、TMB底物液和终止液于4℃储存，试剂盒其余组分于-20℃储存。

应用范围：用于定量检测人组织匀浆、细胞裂解液及其他生物体液中的RNF128。

检测原理：

●本试剂盒基于夹心酶联免疫吸附测定技术。

●96孔板已预先包被抗体，向孔中加入标准品、待测样品及生物素偶联试剂并孵育，随后加入辣根过氧化物酶（HRP）偶联试剂并再次孵育。

●每一步孵育后，使用洗涤缓冲液去除未结合的偶联物。

●通过TMB底物液对HRP的酶促反应进行定量：加入TMB底物液后，仅含足量RNF128的孔会生成蓝色产物，加入酸性终止液后，蓝色产物转变为黄色。

●黄色深浅与板上结合的RNF128含量成正比。

●使用酶标仪在450纳米波长下测定吸光度（OD值），据此计算RNF128的浓度。

试剂盒组分

1.已提供的材料

●预包被96孔微孔板：12×8孔

●标准品：2管

●洗涤缓冲液（25倍浓缩液）：30毫升

●样品/标准品稀释缓冲液：20毫升

●检测试剂A（100倍浓缩液）：120微升

●检测试剂B（100倍浓缩液）：120微升

●稀释液A：10毫升

●稀释液B：10毫升

●TMB底物液：10毫升

●终止液：10毫升

●封板膜：4张

●密封袋：1个

2.所需但未提供的材料

●37℃恒温培养箱

●多通道和单通道移液器及无菌移液器吸头

●洗瓶或自动酶标洗板机

●1.5毫升离心管

●蒸馏水

●吸水滤纸

●100毫升和1升容量瓶

●冰

●酶标仪（波长：450纳米）

●ELISA摇床

实验步骤

 A. 样品制备

样品需立即检测或于2-8℃储存（24小时内）；长期储存需分装后置于-20℃或-80℃，避免反复冻融。样品制备过程中需置于冰上，检测前恢复至室温。

1. 组织匀浆：不同组织的匀浆制备方法有所差异，以下为示例流程。用冰浴PBS冲洗组织以去除残留血液，称重后切碎，在冰浴条件下用组织匀浆机于PBS中匀浆，随后超声处理细胞悬液；10000×g离心5分钟，收集上清液。

2. 细胞裂解液：用胰酶消化贴壁细胞，离心收集后弃去上清液；用冰浴PBS洗涤细胞3次，重悬于PBS中；超声裂解细胞4次，或于-20℃冷冻后室温解冻3次；2-8℃条件下1500×g离心10分钟去除细胞碎片，收集上清液。

3. 其他生物体液：约1000×g离心20分钟去除沉淀物，样品需立即检测或分装后置于-20℃或-80℃储存。

※注意事项

●样品需稀释至预期浓度处于试剂盒检测范围内。

●建议使用新鲜样品或近期获取的样品，以防蛋白质降解和变性导致结果偏差。

●不可使用NaN₃作为样品防腐剂，因其会抑制HRP的活性。

●若可能，固体样品应采用超声和/或匀浆法制备，裂解缓冲液可能（偶尔）影响试剂盒性能。

●若手册应用范围中未提及某类样品，需通过预实验验证试剂盒对该样品的适用性。

 B. 试剂制备

1. 标准品：向标准品中加入1毫升标准品稀释缓冲液，配制为10纳克/毫升的标准品母液（浓度标准品）。复溶后的标准品室温静置10分钟，期间轻轻振荡，避免产生泡沫或气泡。准备离心管并标记，用于梯度稀释——除浓度标准品管外，其余各管加入0.5毫升标准品稀释缓冲液；取0.5毫升浓度标准品母液加入第1管，充分混匀后，从第1管转移0.5毫升至第2管，依次梯度稀释。

    ●注意：复溶标准品时切勿涡旋振荡，以免导致蛋白质失稳；复溶后的标准品需在15分钟内使用，不建议重复使用。

    ●梯度稀释浓度序列（单位：纳克/毫升）：10、5、2.5、1.25、0.63、0.31、0.16

2. 洗涤缓冲液：用蒸馏水将浓缩洗涤缓冲液按1:25比例稀释（即30毫升浓缩洗涤缓冲液加入720毫升蒸馏水）。若浓缩洗涤缓冲液出现结晶，可室温温育并轻轻振荡至结晶溶解。

3. 检测试剂A工作液：实验前15分钟内制备

    ●计算所需工作液总体积；

    ●用稀释液A将检测试剂A按1:100比例稀释，充分混匀，移液时动作缓慢平稳，减少体积误差。

4. 检测试剂B工作液：实验前15分钟内制备

    ●计算所需工作液总体积；

    ●用稀释液B将检测试剂B按1:100比例稀释，充分混匀，移液时动作缓慢平稳，减少体积误差。

 C. 检测步骤

按上述要求制备所有标准品、样品和试剂，使用前将试剂盒组分和样品恢复至室温。建议所有检测做双复孔，并为每次检测绘制标准曲线。

1. 在预包被板上分别设置标准品孔、样品孔和对照（空白）孔，记录各孔位置；向各孔底部加入对应溶液，避免接触孔壁；加样前将标准品和样品上下颠倒混匀，避免产生泡沫或气泡。

2. 向标准品孔中加入100微升稀释后的标准品。

3. 向对照（空白）孔中加入100微升标准品稀释缓冲液。

4. 向样品孔中加入100微升适当稀释的样品，轻轻拍打平板或使用酶标摇床混匀。

5. 用封板膜覆盖平板，37℃孵育2小时。

6. 揭开封板膜，弃去孔内液体，暂不洗涤。

7. 向各孔加入100微升检测试剂A工作液，用封板膜覆盖平板，37℃孵育1小时。

8. 揭开封板膜，弃去孔内溶液，用1×洗涤缓冲液洗涤平板3次：用多通道移液器或自动洗板机向各孔加满洗涤缓冲液（350微升），建议浸泡1-2分钟；每步需弃去孔内液体，末次洗涤后，通过抽吸或倾倒去除残留洗涤缓冲液，将平板倒置在干净的吸水滤纸上拍干。

9. 向各孔加入100微升检测试剂B工作液，密封平板，37℃孵育1小时。

10. 揭开封板膜，弃去孔内溶液，按步骤8方法重复洗涤5次。

11. 向各孔加入90微升TMB底物液，用封板膜覆盖平板，轻轻拍打混匀，37℃孵育10-20分钟（孵育时间仅供参考，时间需用户自行确定），避免光照。

12. 向各孔加入50微升终止液，需快速且均匀地混匀整个平板内的终止液，确保酶灭活。

13. 确保平板底部无指纹和水渍，孔内液体无气泡，立即在450纳米波长下测定吸光度（OD值）。

计算方法

计算各标准品孔和样品孔的OD450平均值，减去对照（空白）孔的OD平均值：

相对OD值=各孔OD值-空白孔OD值

以各标准品溶液的相对OD值为X轴，对应标准品浓度为Y轴绘制标准曲线；根据样品的相对OD值，从标准曲线上插值得到样品浓度。若样品已稀释，需将插值得到的浓度乘以稀释倍数，即为样品的原始浓度。

※注意事项

1. 使用试剂盒前，离心各试管，使附着在管盖上的组分沉降至管底。

2. 孵育间隔期间，切勿长时间敞露孔板；每步加样时间不应超过10分钟。

3. 孵育过程中需确保平板密封良好，严格控制孵育时间和温度。

4. 移液器吸头和试管不可重复使用。

5. 不可使用过期组分或不同试剂盒的组分。

6. TMB底物液需在无菌条件下使用，尽量减少光照；未使用的底物液应为无色或极浅的黄色，切勿将剩余溶液倒回原瓶。

7. 本试剂盒经优化用于检测天然样品，而非重组蛋白或合成化合物；由于重组蛋白的序列或三级结构可能与天然蛋白不同，无法保证对重组蛋白的检测效果。

精密度

1. 批内精密度（同一次实验的精密度）：对3份低、中、高浓度的RNF128样品，在同一块平板上各检测20次。

2. 批间精密度（不同实验间的精密度）：对3份低、中、高浓度的RNF128样品，在3块不同平板上检测，每块平板做8个复孔。

变异系数（CV）计算公式：CV（%）=（标准差/平均值）×100

●批内变异系数：＜6%

●批间变异系数：＜10%

典型数据与标准曲线

提供的典型标准曲线数据仅用于演示，每次实验均需重新绘制标准曲线。

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（注：本文内容基于品牌公开资料及行业常规信息整理，具体以品牌信息文档为准。）