Promega ONE-Glo™ Luciferase Assay System （货号 E6120） 中文说明书

第一部分：产品描述

品牌（Brand）： Promega

英文名（English Name）： ONE-Glo™ Luciferase Assay System

中文名（Chinese Name）： ONE-Glo™ 萤光素酶检测系统（亦常被称为ONE-Glo™ 萤光素酶报告基因均相检测试剂盒）

货号（Catalog Number）： E6120

规格（Size）： 100ml（系统总容量），包含 100ml ONE-Glo™ Luciferase Assay Buffer 以及 1瓶（vial）冻干态（lyophilized）的 ONE-Glo™ Luciferase Assay Substrate。

预期用途： 本品仅供科学研究使用，不得用于人体诊断、治疗或其他临床程序。本系统专为哺乳动物细胞中萤火虫（Firefly）萤光素酶报告基因的表达定量而设计，采用均质（Homogeneous）的一步法检测原理。

第二部分：产品概述与背景

在分子生物学、药理学和生物医学研究中，科学家经常需要追踪特定基因在细胞内的表达情况。为了实现这一目标，研究人员开发出了“报告基因（Reporter Gene）"技术。其中，萤火虫萤光素酶（Firefly Luciferase，简称 Fluc）因其催化反应能够产生强的生物发光信号，且背景噪音极低，成为了极受欢迎的报告基因工具。

然而，随着现代药物筛选和基因组学研究的飞速发展，科研工作者对实验通量提出了高的要求。传统的萤光素酶检测试剂往往存在诸多局限：例如试剂配制后极不稳定、发光信号衰减过快导致无法完成大规模连续读数、对细胞培养基中的成分（如酚红、血清、抗氧化剂等）高度敏感导致假阴性，以及在手工或机械臂加样过程中极易产生泡沫干扰信号等。

正是为了攻克上述技术瓶颈，Promega 公司依托其深厚的酶工程与生物化学底蕴，研发推出了 ONE-Glo™ Luciferase Assay System。该系统采用了一种全新的萤光素酶底物化学配方。它不仅大幅提升了试剂在溶解后的物理和化学稳定性，还显著降低了传统试剂有的刺鼻气味，并且对常见的实验干扰因素展现出了优异的耐受性。货号 E6120 作为其 100ml 的中等规模包装，极其适合中小型实验室开展 384 孔板乃至 1536 孔板的高通量筛选工作。

第三部分：工作原理详解

要深刻理解 ONE-Glo™ 系统的强大之处，我们需要从其底层的生物化学反应机制说起。萤火虫萤光素酶（Luciferase）是一种分子量约为 60 kDa 的单体蛋白，它能够催化底物发生氧化反应，并将化学能转化为光能。

1. 经典的两步发光机制

在经典的萤火虫萤光素酶反应中，通常需要以下几种核心底物：D-荧光素（D-Luciferin）、三磷酸腺苷（ATP）、镁离子（Mg²⁺）以及氧气。反应过程主要分为两步：

• 第一步（腺苷化反应）： 萤光素酶首先催化 D-荧光素与 ATP 结合，生成荧光素-腺苷酸中间体（Luciferyl-adenylate），同时释放出一分子的焦磷酸（PPi）。

• 第二步（氧化发光反应）： 在氧气的存在下，该中间体被氧化生成处于激发态的氧化荧光素（Oxyluciferin），当激发态的氧化荧光素回到基态时，便会释放出一个光子，产生我们肉眼可见的生物发光现象。

2. ONE-Glo™ 系统的化学改良

传统的商用检测试剂大多直接使用 D-荧光素作为底物。D-荧光素在水溶液中容易发生自发的非酶促氧化，这导致试剂在溶解后极不稳定，需要现配现用，且伴随着强烈的硫醇类刺激性气味。

ONE-Glo™ 系统则采用了一种 Promega 保护的新型萤光素酶底物。这种底物经过特殊的化学修饰，具有以下理化特性：

• 更强的抗自氧化能力： 即使在室温或含氧环境中，该底物的自发降解速率也远低于 D-荧光素，从而赋予了试剂长期稳定性。

• 更低的挥发性有机物（VOCs）释放： 极大地消除了传统试剂令人不适的气味，改善了实验室人员的操作环境。

• 优化的酶动力学曲线： 该底物与萤光素酶的结合效率更高，产生的光子流更强，且“辉光（Glow-type）"持续时间更长（可达 40 分钟以上），为高通量仪器的连续读数留足了时间窗口。

当 ONE-Glo™ 试剂加入到含有萤光素酶报告基因的细胞样品中时，试剂中的去污剂成分会瞬间温和地裂解细胞膜，将细胞内的萤光素酶释放到溶液中。随后，新型底物在酶的催化下迅速发生氧化反应，产生与细胞内萤光素酶表达量呈严格正相关的发光信号。科研人员只需使用微孔板读板机检测发光强度（Relative Light Units, RLU），即可精准计算出目标基因的相对表达水平。

第四部分：产品核心特点深度解读

1. 灵活便捷的储存条件，打破冷链束缚

对于常规的生物酶类试剂，严格的低温冷冻往往是维持活性的手段。然而，ONE-Glo™ 系统在配方设计上实现了突破。数据显示，其溶解后的 ONE-Glo™ 试剂在室温（约 22°C）下可以稳定存放长达 3 周，而在 2°C 至 10°C 的普通冰箱冷藏环境下更是可以稳定保存 3 个月，期间试剂的功能性仅有约 12% 的自然衰减。这意味着研究人员不再需要频繁地将试剂在冰盒与冰箱之间来回转移，极大地简化了日常实验的准备流程，同时也为自动化工作站的全天候连续运行扫清了障碍。

2. 尊享清新操作环境，告别刺鼻异味

做过传统萤光素酶实验的科研人员一定深有体会，普通 D-荧光素试剂在溶解和反应过程中会释放出一股浓烈的、类似于臭鸡蛋或腐烂蔬菜的挥发性硫化物气味。这不仅严重影响了实验室的空气质量，长期吸入还可能对实验人员的呼吸道造成刺激。ONE-Glo™ 的新型底物从根本上解决了这一痛点，其在整个实验过程中几乎不产生任何难闻气味，为您和团队提供了一个更加舒适、健康的科研环境。

3. 抗扰能力，无视混合与分装误差

在 384 孔板或 1536 孔板的高通量实验中，机械臂的分液精度和加样后的混匀力度很难做到孔与孔之间全一致。某些敏感的发光试剂在遭遇剧烈震荡或形成微小气泡时，发光信号会出现剧烈波动，导致数据的重现性极差（High CV%）。ONE-Glo™ 试剂展现出了佳的物理耐受性，它对混合和分装条件的变化极不敏感。无论是在手工操作中稍微摇晃了几下，还是自动化设备留下了微小的气泡，其最终的读数都能保持高度的一致性和稳定性，从而大幅提升了实验结果的可靠程度。

4. 专为高密度微孔板量身定制

随着药物筛选通量的提升，越来越多的实验室开始普及 384 孔板和 1536 孔板。在这些高密度孔板中，每孔的加样体积往往被压缩在几微升到几十微升之间，极小的液体体积使得蒸发效应和热散失变得尤为显著。ONE-Glo™ 试剂凭借其独特的缓冲体系和底物配方，即使在如此小体积、高密度环境下，依然能够提供明亮且持久的发光信号，是开展 siRNA 文库筛选、CRISPR 全基因组敲除筛选的理想搭档。

5. 更强的基质效应耐受力，弱化假阴性风险

哺乳动物细胞的生长离不开复杂的培养基，而培养基中往往含有酚红（pH 指示剂）、血清蛋白、各种氨基酸以及抗氧化剂（如维生素C、谷胱甘肽等）。这些物质中，酚红和维生素C恰恰是萤光素酶催化反应的天敌，它们会通过淬灭自由基或直接消耗底物的方式来抑制发光信号。ONE-Glo™ 系统经过特殊优化，对这些常见的细胞培养基成分具有高的耐受阈值。研究人员甚至可以在不全移除培养基的情况下直接进行检测，这不仅节省了洗板的时间，更避免了因清洗不全或细胞脱落所带来的数据偏差。

第五部分：储存与运输条件

为了保证 ONE-Glo™ Luciferase Assay System (E6120) 的最佳性能，请务必严格遵守以下储存与运输规范：

1. 未开封的原始试剂储存

• ONE-Glo™ Luciferase Assay Buffer (100ml, 子货号 E605B)： 收到产品后，应将其存放于 -30°C 至 -10°C 的低温冰箱中。若短期内（3个月内）频繁使用，也可将其置于 2°C 至 10°C 的普通冷藏室，其功能性变化极小（约 10%）。

• ONE-Glo™ Luciferase Assay Substrate (1 vial, 子货号 E606B)： 冻干粉状态极不稳定，必须在 -30°C 至 -10°C 的环境下避光保存。

2. 运输条件

本产品在运输过程中会使用干冰或足量冰袋进行包装，以确保其始终处于规定的低温区间内。

3. 试剂复溶后的储存（重要提示）

当您将 Buffer 加入到 Substrate 冻干粉中，配制成 ONE-Glo™ Reagent（工作液）后，其储存条件变得非常宽容：

• 室温（约 22°C）： 可稳定保存 3 周。

• 冷藏（2°C 至 10°C）： 可稳定保存 3 个月。

• 冷冻（-20°C）： 不建议反复冻融。一旦复溶，建议在有效期内一次性用完或分装保存。

第六部分：实验所需材料与试剂配制

1. 实验所需自备材料

• 表达萤火虫萤光素酶的哺乳动物细胞（贴壁或悬浮均可）。

• 标准细胞培养体系（含血清的培养基，不含干扰性过高的抗氧化补充剂）。

• 可调量程移液器及无菌吸头（如进行高通量实验，需配备多通道移液器或自动分液器）。

• 适用于发光检测的白色不透明微孔板（推荐使用 Corning、Greiner 等品牌的白色底板，以减少孔间信号串扰）。

• 微孔板发光检测仪（Luminometer），具备单次读取或动力学读取模式。

2. ONE-Glo™ 工作液的配制步骤

• 取出一瓶全解冻（或平衡至室温）的 ONE-Glo™ Luciferase Assay Buffer (100ml)。

• 将 Buffer 全部倒入装有 ONE-Glo™ Luciferase Assay Substrate (冻干粉) 的玻璃瓶中。

• 盖紧瓶盖，用手轻轻上下颠倒混匀，直至瓶底的白色冻干粉全溶解，溶液变为澄清透明状（此过程通常需要 1 至 2 分钟）。

• 注意：请勿使用涡旋振荡器（Vortex）剧烈震荡，以免产生大量难以消除的泡沫，影响后续加样精度。

第七部分：标准实验操作流程 (SOP)

第一步：细胞培养与模型构建

根据您的实验设计，将稳定转染或瞬时转染了萤火虫萤光素酶报告基因的细胞接种于合适的微孔板中。以 96 孔板为例，每孔接种 1×10⁴ 至 2×10⁴ 个细胞；以 384 孔板为例，每孔接种 5×10³ 个左右。将细胞置于 37°C、5% CO₂ 的培养箱中过夜培养，待细胞贴壁并达到约 70% - 80% 的融合度时，进行后续的药物或基因处理。

第二步：施加实验干预

根据您的课题需求，向细胞中加入待测化合物（如药物小分子、siRNA、质粒等）或相应的对照溶剂。继续培养所需的时间（通常为 6 小时至 48 小时不等，视具体信号响应动力学而定）。

第三步：去除培养基（可选）

如果您使用的是普通的非酚红培养基，且细胞状态良好，您可以直接跳过洗板步骤，带着培养基进行第四步。但如果您的培养基中含有高浓度的干扰物质，或者您追求低背景，可以使用移液器小心吸走旧培养基，并根据需要加入 20µl 至 50µl 的新鲜普通培养基或 PBS。

第四步：加入 ONE-Glo™ 检测试剂

将配制好的 ONE-Glo™ Reagent 平衡至室温。按照与孔内原有液体体积 1:1 的比例加入检测试剂。例如，如果孔内留有 100µl 的培养基，则加入 100µl 的 ONE-Glo™ Reagent。如果是无培养基的干孔，则直接加入 100µl 试剂。

• 小型实验： 使用多通道移液器快速加入。

• 高通量实验： 使用自动分液器（如 Multidrop™）设定好流速和体积进行分装。

第五步：轻晃混匀与孵育

加样完毕后，使用微孔板振荡器（Orbital Shaker）以中等转速（约 300-500 rpm）轻晃微孔板 2 至 5 分钟，确保裂解液与细胞充分接触并使酶促反应达到平衡。或者，如果您使用的是可自动振荡的读板机，也可以在进舱前手动混匀。

第六步：检测发光信号

将微孔板放入微孔板发光检测仪中。设置仪器参数：通常不需要设置激发光滤光片（因为萤光素酶是生物发光，不需要激发），发射光检测范围设为全波长或 550nm - 600nm。建议积分时间设置为 0.5 秒至 1 秒每孔。记录下各个孔位的相对发光单位（RLU）数值。

第八部分：本产品解决的实验痛点剖析

在过往的科研实践中，许多实验室在使用传统萤光素酶检测系统时，常常陷入以下困境，而 ONE-Glo™ 正是为解决这些问题而生：

• 痛点一：试剂“见光死"，半衰期太短

 传统试剂溶解后必须在几个小时内测完，否则信号骤降。ONE-Glo™ 打破了这一问题，其长达数周的室温稳定性，让您可以上午配液，下午甚至第二天再从容读数。

• 痛点二：气泡杀手，数据忽高忽低

 在快速加样时，液体撞击液面极易产生气泡。传统试剂遇到气泡，光信号会被折射或遮挡，导致同一次实验的数据变异系数（CV%）居高不下。ONE-Glo™ 对物理扰动具有免疫力，即使带有微量气泡，读数依然坚挺。

• 痛点三：怕水又怕脏，基质干扰大

 很多实验需要在含有高浓度血清或特定添加剂的培养基中进行。传统试剂一旦遇到酚红或抗氧化剂，发光信号会被抑制 50% 甚至更多。ONE-Glo™ 拥有高的“抗污"能力，在复杂的培养体系中依然能保持信号的线性响应。

• 痛点四：气味熏天，通风橱里都扛不住

 实验室的通风系统有时候也扛不住劣质试剂的恶臭。ONE-Glo™ 的环保无味配方，让您可以安心在超净台或普通实验台上操作，不必时刻屏住呼吸。

• 痛点五：小体积检测信号弱，蒸发惹的祸

 在 1536 孔板中，几微升的试剂眨眼间就会蒸发变干。ONE-Glo™ 的缓冲体系能有效减缓蒸发带来的影响，保证小体积下的信号强度。

第九部分：常见问题与解决方案 (Troubleshooting)

问题一：发光信号整体偏弱，甚至接近空白背景

• 可能原因： 细胞转染效率过低；萤光素酶表达量本身极低；检测试剂配制错误（如 Buffer 未全溶解底物）；或者细胞数量过少。

• 解决方案： 优化转染条件（如更换转染试剂、调整 DNA 与转染试剂比例）；增加细胞接种密度；仔细检查试剂配制步骤，确保冻干粉全化开；延长加样后的孵育时间至 10 分钟后再读数。

问题二：实验组与对照组之间没有显著差异（无响应）

• 可能原因： 药物或刺激因子剂量不足；作用时间不够；报告基因载体构建有误（如启动子序列缺失）；或者细胞系对该通路不敏感。

• 解决方案： 进行药物的梯度稀释测试，寻找最佳起效浓度；延长药物处理时间；重新测序验证载体的准确性；尝试使用阳性对照质粒（如 pGL3-Control）来确认系统是否正常运作。

问题三：数据重现性差，孔间差异极大（CV% > 20%）

• 可能原因： 加样时产生了大量气泡且未消除；微孔板震荡混匀不均匀；细胞在铺板时分布不均（贴壁细胞聚团）。

• 解决方案： 降低移液器的退吸速度，或使用反向移液法减少气泡；确保微孔板在振荡器上放置平稳；在铺板前使用胰酶充分消化细胞，并用移液枪反复吹打制成真正的单细胞悬液。

问题四：标准曲线线性关系变差

• 可能原因： 萤光素酶浓度过高，发生了底物耗尽（Substrate depletion）；或者检测试剂过期失效。

• 解决方案： 对高表达的样本进行梯度稀释后重测；在检测高浓度样本时，适当增加 ONE-Glo™ Reagent 的加入量；检查试剂的有效期及储存温度。

问题五：背景孔（Blank）读数异常偏高

• 可能原因： 微孔板洁净度不够，有还原性物质残留；发光检测仪的光路系统受到污染；或者 Buffer 受到荧光素酶的污染。

• 解决方案： 使用全新的无菌微孔板；定期清洁和维护读板机；确保 ONE-Glo™ 试剂瓶瓶口洁净，取用后立即封口。

问题六：不同批次试剂之间存在系统误差

• 可能原因： 不同批次间的底物活性存在微小统计学波动；或者实验操作人员发生了变动。

• 解决方案： 在进行跨批次的大规模筛选实验时，务必在各批次中加入相同的质控品（Control），以便在后期数据分析时进行归一化处理。

问题七：试剂在低温下出现结晶或沉淀

• 可能原因： ONE-Glo™ Buffer 中含有高浓度的盐类或缓冲成分，在低温冷冻下溶解度下降，属于正常的物理现象。

• 解决方案： 将试剂瓶取出，置于室温下自然回温，并轻轻摇晃，待结晶全溶解、溶液变澄清后即可正常使用，不影响性能。

问题八：读数时出现明显的双峰或信号延迟

• 可能原因： 发光检测仪的参数设置不当（如延迟时间 Delay Time 设置过长或过短）；或者裂解过程不彻。

• 解决方案： 优化仪器参数，通常 Delay Time 设为 0 或 1 秒，Integration Time 设为 0.5 至 1 秒；延长微孔板的摇匀时间，确保细胞充分裂解。

问题九：细胞在加样后大量漂浮或脱壁

• 可能原因： ONE-Glo™ 试剂中的去污剂浓度对某些极度脆弱的细胞系（如原代神经元细胞、悬浮淋巴细胞）来说略高，导致膜结构瞬间崩解。

• 解决方案： 尝试用无血清培养基 1:1 稀释 ONE-Glo™ Reagent 后再加入孔中；或者在加样前先弃去大部分培养基，保留极少量液体作为缓冲。

问题十：长时间（>2小时）孵育后信号急剧下降

• 可能原因： 虽然 ONE-Glo™ 稳定性佳，但在高温（>30°C）环境下，或者底物浓度被极度稀释时，仍可能发生缓慢降解。

• 解决方案： 尽量在室温（20-25°C）环境下进行操作；如果需要极长的孵育时间，建议分批上机检测，每次只拿出当前要测的板子。

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更多产品信息，请联系中国区域代理商：上海起发实验试剂有限公司

（注：本文内容基于品牌公开资料及行业常规信息整理，具体以品牌信息文档为准。）

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