Bio-Rad 1610374 Precision Plus Protein Dual Color Standards说明书

基本信息概览：

• 产品品牌： 伯乐（Bio-Rad）

• 英文全名： Precision Plus Protein Dual Color Standards

• 中文译名： Precision Plus 蛋白质双色标准品（常被称为双色预染蛋白Marker或蛋白梯）

• 产品货号： 1610374

• 产品规格： 500 μl（微升）

• 应用次数： 约50次应用（按每次电泳上样10 μl计算）

• 分子量范围： 10 kDa – 250 kDa

• 条带数量： 共计10条 distinct（界限分明）的重组成蛋白条带

• 染料特征： 8条蓝色染色条带，2条粉红色（高亮品红）参考条带

• 配套加样缓冲液成分： 含有30% (w/v) 甘油、2% SDS、62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8)、50 mM DTT（二硫苏糖醇）、5 mM EDTA 以及 0.02% NaN3

产品特点

1. 优异的整体亮度与视觉稳健性

   本产品采用了先进的共价偶联染色工艺，使得染料与重组蛋白质分子间形成稳定的结合。这不仅大幅提升了各条带在凝胶内的初始亮度，更确保了在整个蛋白质电泳及后续的Western Blotting（蛋白质印迹）全流程中，实验人员都能获得强的视觉追踪信号。无论是在凝胶成像系统的透射光下，还是在转膜后的膜上检测环节，其亮度表现均展现出高的可靠性。

2. 双色设计带来的直观判读体验

   标准品中特别设定了25 kDa和75 kDa两条粉红色参考条带，其余8条（10, 15, 20, 37, 50, 100, 150, 250 kDa）则为醒目的蓝色。这种双色组合打破了单色Marker在泳道中容易产生的视觉疲劳感，使得研究人员在密集的点样孔中能够迅速定位关键分子量区间，极大地提高了实验数据的读取效率与准确性。

3. 更强的印迹持久性与转膜信心

   在Western Blot实验中，普通的预染Marker往往在湿转或半干转过程中发生严重的弥散或脱落。本产品通过特殊的缓冲体系保护，赋予了蛋白条带强的膜结合Persistence（持久性）。即便在经历了封闭、一抗孵育、二抗结合以及多次严苛的洗膜步骤后，粉红与蓝色条带依然能够稳固地锚定在膜上。这为科研人员在化学发光显色后重新校准目标蛋白的分子量位置提供了参照信心。

4. 宽泛的分子量覆盖与精确的对应性

   从10 kDa的小分子多肽到250 kDa的大分子复合体，这10个重组蛋白节点均匀分布在对绝大多数天然蛋白质具有高度代表性的分子量区间内。它们不仅可用于粗略估计未知样品的大小，还能作为内参，验证电泳系统的分离线性度是否达标。‘’

工作原理

1. SDS-PAGE 变性与电荷屏蔽效应

本产品直接上样于聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）中。在规定的上样缓冲液和加热变性条件下，标准品中的重组蛋白与样本蛋白一样，其分子内及分子间的氢键和二硫键被二硫苏糖醇（DTT）和SDS破坏，肽链伸展。此时，SDS以其疏水端与蛋白质的疏水区域相结合，形成蛋白质-SDS复合物。由于SDS带有大量负电荷，它有效屏蔽了不同蛋白质自身所带电荷的差异，使得所有复合物均携带与其长度（分子量）成正比的净负电荷。在电场驱动下，这些复合物向正极迁移，速率仅取决于其流体力学半径，从而实现了依据分子量大小的高效分离。

2. 共价偶联染料的实时示踪机制

传统非预染标准品在电泳结束后需要通过考马斯亮蓝等外部染料进行耗时较长的染色脱色才能显色。而本产品在生产阶段已将高亲和力的蓝色与粉红色共价有机染料预先偶联至各个重组蛋白上。这些染料不仅不会影响蛋白质在凝胶基质中的正常迁移率，还能使其在紫外或可见光源下直接发射出强烈的荧光或吸收特定波长的光。这使得研究人员可以在电泳运行期间，透过电泳槽的透明外壳实时监控蛋白质的分离状态，精准把握制胶质量和停止电泳的最佳时机。

3. Western Blot 半干转/湿转的物理吸附与扩散平衡

在将凝胶中的蛋白质转移至固相载体（如PVDF或NC膜）的过程中，预染染料的存在同样至关重要。染料分子具有一定的极性和分子量，它们在转移缓冲液中随电流向膜移动。由于本产品的缓冲液配方经过了精细调节，确保了染料-蛋白复合物在跨过凝胶与膜的界面时能迅速且牢固地吸附在膜纤维表面。这种物理吸附力足以抵抗后续清洗步骤中的液体剪切力，从而在最终的杂交膜上留下清晰、持久的分子量标尺。

解决实验中的哪些问题

1. 消除“盲上样"带来的资源浪费

   在未使用预染标准品的传统实验中，研究人员只能凭经验设定电泳时间。一旦时间不足，大分子蛋白未能有效分离；一旦超时，小分子蛋白便会从凝胶底部流失。本产品充当了“进度条"，让实验者对分离程度一目了然，避免了因时机把控失误而导致的珍贵样本报废。

2. 攻克转膜效率“黑盒化"的困境

   Western Blot 的转膜步骤往往是个“黑盒"，研究者难以直观判断大分子量的目标蛋白是否成功从凝胶转移到了膜上。通过使用本双色标准品，转膜完成后只需简单观察膜上的粉红与蓝色条带，即可瞬间确证转印系统的运行状态以及各分子量区段的实际转移效率，从而及时调整转膜时间与电流强度。

3. 提升低丰度靶蛋白定性的置信度

   当目标蛋白的信号较弱或背景较深时，准确判定其分子量位置变得异常困难。本产品提供的10个精准节点，特别是在25 kDa和75 kDa处具有高亮度的粉红色标，为后期胶片分析或成像仪扫描提供了绝对的参照坐标系，有效防止了将非特异性结合误判为目标蛋白的假阳性风险。

4. 简化操作流程，提升实验通量

   由于无需额外的染色、脱色步骤，本产品极大缩短了实验周期。尤其是在需要进行快速质控筛选的高通量实验中，直接上样、即时观测的特性显著提升了整体工作效率。

使用方法

为了获得最佳的实验结果，请结合您的具体实验平台，严格参考以下标准化的操作流程。

1. 实验前的准备工作

• 解冻与混匀： 使用前，请将产品从冰箱取出，置于冰上缓慢解冻。解冻后，涡旋振荡10-15秒，确保管底无沉淀，溶液呈均一的混浊液状态。短暂离心（如10,000 x g，10秒）以收集管壁液滴。

• 热处理（可选但推荐）： 尽管本产品在大多数情况下可直接上样，但为了与样品处理条件保持一致，建议将Marker与待测样品一同置于95℃-100℃金属浴中加热3-5分钟。这有助于破坏蛋白的二级结构，使其在凝胶中呈现出最锐利的条带。

2. 常规 SDS-PAGE 上样操作

• 上样量确定： 对于标准的微型凝胶（如Bio-Rad的Mini-PROTEAN系列，胶厚1.0 mm - 1.5 mm），建议单次上样体积为 10 μl。若使用大型凝胶或制备胶，请按比例增加上样量至15-20 μl。

• 点样孔分配： 建议在凝胶的点样梳齿两侧边缘孔位以及样品组的中间穿插点入本产品。这样既能校正由于边缘效应导致的弯曲，又能为中央区域的样品提供双向的标尺参照。

• 电泳条件： 通常使用恒压模式。先以80V左右电压运行至样品压缩成一条细线并进入分离胶，随后将电压升至120V-150V，直至蓝色染料前沿（溴酚蓝指示剂包含在缓冲液中）接近凝胶底部边缘即可停止。

3. Western Blot 转膜与后续处理

• 转膜前观察： 电泳结束后，可在白色背景的光箱上直接观察凝胶中的双色条带。粉红色条带（25和75 kDa）应当呈现清晰的线状，无拖尾。

• 转膜操作： 按照常规的湿转或半干转程序进行。本产品的转移效率与大多数哺乳动物蛋白质相似。

• 转膜后确认： 转膜完毕后，取出膜（PVDF或NC膜），在TBST缓冲液中短暂漂洗，此时即可肉眼看到膜上留下的蓝/粉红双色阶梯。以此评估转印质量。随后进行常规的封闭（如使用5%脱脂牛奶或BSA）和抗体孵育步骤。值得注意的是，本产品的条带在经过ECL等化学发光底物激发时，可能会产生轻微的背景荧光，但这全不影响目标条带的最终成像判定。

4. 特殊凝胶体系的适配

当使用梯度凝胶（如4-20%梯度胶）或非变性凝胶时，由于孔径分布或电荷效应的差异，各条带的相对迁移率可能会发生微小偏移。此时，建议每次实验都随胶跑一份本标准品，并建立该特定凝胶体系下的专属标准曲线（Rf值与LogMW的线性关系）。

储存条件与试剂维护

正确的储存与维护是确保本产品长期保持活性的关键。

• 短期储存（日常使用）： 开瓶后，建议存放于 4℃ 冰箱。在此温度下，产品可保持稳定长达 6个月（或直至包装标示的有效期，以较晚者为准）。

• 长期储存（闲置备用）： 若预计超过6个月不使用，或为了防止频繁冻融破坏蛋白结构，强烈建议将其分装（如按每次用量10-20 μl分装于低吸附离心管中），并储存于 -20℃ 冷冻室。

• 避光要求： 尽管偶联染料具有一定的光稳定性，但长期暴露于强光或紫外线下仍可能导致荧光淬灭。请尽量将原管保存在不透明的盒子中或铝箔纸包裹的环境下。

• 污染防范： 由于产品中含有极微量的NaN3作为防腐剂，切勿使用嘴吸式移液器吸取，并避免与酸性溶液混合，以防产生有毒的叠氮酸气体。操作完毕后立即盖紧管盖，防止缓冲液挥发导致甘油浓度升高或盐析现象发生。

常见问题与解决方案（FAQ）

问题一：凝胶中的蛋白条带出现明显的“微笑"形（两端向上弯曲）或“皱眉"形（两端向下弯曲）弯曲。

深度剖析： 这通常并非标准品本身的质量问题，而是凝胶聚合不均或电泳过程中产生的焦耳热导致的。

解决对策： 

• 若是“微笑"状，多是因为两边缘散热较快，导致凝胶中部温度高于两侧，中部迁移速度快。建议降低电泳电压（如从150V降至120V），或在4℃冷室中进行电泳以增加散热均匀度。

• 若是“皱眉"状，则可能是制胶时边缘的分离胶液面不平，或者点样孔内残留气泡导致局部电场畸变。制胶时需确保加入分离胶后，上方覆盖异丙醇液面绝对水平；上样前用微量注射器或毛细管去除点样孔内的气泡。

问题二：双色条带之间的分辨率下降，原本独立的条带相互融合（例如10, 15, 20 kDa挤在一起）。

深度剖析： 主要发生在分离胶浓度过高，或者上样量超载导致蛋白带展宽。

解决对策： 

• 检查所配制的分离胶浓度是否过高。若目标分子量较小（<25 kDa），建议使用15%或更高的分离胶，并适当延长电泳时间，让小分子充分展开。

• 减少Marker的上样量。有时10 μl过量，可尝试降为5 μl，用1x SDS上样缓冲液稀释混匀后再上样。

• 确保电泳缓冲液（Tris-Glycine-SDS）的pH值和离子强度正确，陈旧的电泳液会导致条带拖尾融合，建议定期更换。

问题三：转膜后，膜上的粉红色参考条带（25, 75 kDa）极淡甚至消失，但蓝色条带可见。

深度剖析： 粉红色染料与蛋白质的偶联化学键在某些pH值或高甲醇含量的转膜液中可能发生部分解离；或者这两种特定分子量的重组蛋白在转膜过程中穿透了膜的孔径。

解决对策： 

• 检查转膜液（Transfer Buffer）的配方。若使用的是PVDF膜，甲醇浓度通常为20%；若为NC膜，可降低至10-15%。过高的甲醇会使膜孔径收缩过度，反而阻碍大分子转移，同时加速染料脱落。

• 缩短转膜时间。对于250 kDa以下的中小分子，90分钟的湿转（恒流200-300 mA）通常足够。过度转膜会导致小分子Marker穿透膜进入滤纸。

• 确保转膜时凝胶靠近负极（黑色极），膜靠近正极（红色极），且两者之间没有气泡阻隔。

欧题四：在Western Blot最后显色（如ECL化学发光）时，发现Marker条带也发出了强烈的荧光信号，严重干扰了邻近目标带的观察。

深度剖析： 本产品所含的某些染料在特定波长下可能具有类似于辣根过氧化物酶（HRP）底物氧化的特性，或者微量的DTT残留与发光液发生了非特异性反应。

解决对策： 

• 在加入ECL等化学发光底物前，用TBST强力洗涤膜3次，每次5分钟，去除残留的二价铁离子或还原剂。

• 调整曝光策略。由于Marker的发光通常是瞬态的且强度高，可以先对Marker进行一次极短时间的曝光（如1秒），记录下条带位置后，再针对目标蛋白进行长曝光捕捉。后期使用Image Lab等软件进行分析时，将两次曝光的图层进行叠加对齐。

问题五：标准品在-20℃冻存一段时间后，解冻上样发现条带亮度显著变暗。

深度剖析： 反复的冻融循环会破坏蛋白质的高级结构，导致共价结合的染料发生构象改变而失去荧光/发色能力；此外，冷冻可能导致缓冲液中的SDS结晶析出。

解决对策： 

• 严格遵循“小量分装"的原则。在收到产品时，即将500 μl原液按10 μl或20 μl一份分装到多个低吸附管中，标记好日期，每次实验仅取出一管使用，避免反复冻融主液。

• 冻存的管子必须全解冻并充分涡旋混匀后才能使用。若发现管底有白色沉淀（SDS析出），可在37℃水浴中轻摇促溶，切勿直接上样。

问题六：跑非变性胶（Native PAGE）时，Marker条带弥散不清。

深度剖析： 本产品是专为变性胶（SDS-PAGE）设计的。在非变性条件下，蛋白质保持其天然折叠状态，且带有自身的净电荷。SDS会改变蛋白天然电荷，本产品中的蛋白在非变性胶中迁移率极不可控。

解决对策： 

• 本产品不适用于非变性胶或等电聚焦（IEF）实验。若需在非变性条件下测定分子量，必须购买专门用于Native条件的非变性预染Marker（如Bio-Rad的其他特定货号产品）。

问题七：上样孔中有大量蓝色的染料残留，未能进入分离胶。

深度剖析： 上样缓冲液中的甘油是为了增加密度使样品沉底，但如果Marker未充分混匀，或者点样孔底部的凝胶存在断层，就会导致高密度液体滞留。

解决对策： 

• 上样前务必简短离心并充分涡旋。

• 检查点样梳是否拔起过快，导致边缘孔壁破裂。可以用针头轻轻划破边缘孔壁的凝胶，帮助样品沉降。

• 适当下调初始电压，让样品在浓缩胶中充分线性压缩后再进入分离胶。

问题八：在转印到PVDF膜上后，进行免疫检测时出现了高的背景噪点。

深度剖析： PVDF膜具有较强的疏水性，如果封闭不充分，血浆蛋白（本产品为重组蛋白，虽非血清来源但也属外源蛋白）极易吸附抗体造成背景。

解决对策： 

• 转膜前，PVDF膜必须经过纯甲醇活化（通常15-30秒），随后在转移缓冲液中平衡5-10分钟。未进行充分活化的膜对蛋白质的吸附极弱，容易导致Marker脱落并游离在缓冲液中，这些游离蛋白随后会吸附在膜的其他区域。

• 加强封闭步骤。使用5% BSA（牛血清白蛋白）而非脱脂牛奶进行封闭，因为牛奶中的酪蛋白可能与某些二抗发生交叉反应。封闭时间可延长至1-2小时室温，或4℃过夜。

问题九：使用梯度胶时，高分子量区域（如150, 250 kDa）的条带分离效果不佳，呈球形斑点。

深度剖析： 梯度胶的底部浓度较高（如20%），大分子蛋白在其中的迁移阻力极大。如果在进入高浓度区域前电泳就停止了，它们就会堆积在交界处。

解决剖析： 

• 延长电泳时间，适当降低电压，给予大分子足够的迁移动力穿越高浓度凝胶网孔。

• 确保上样体积不要过大，过大的体积会导致样品在浓缩胶中形成柱状而不是薄层，进入分离胶后就会形成“球形"的前沿。

问题十：Marker在储存液中出现絮状沉淀或分层现象。

深度剖析： 这可能是由于储存温度不当（如长期处于4℃但遭受频繁震动），或者由于容器密封不严导致水分挥发，缓冲液盐离子过饱和析出。

解决对策： 

• 轻微震荡通常可以使沉淀重新溶解。若无效，可进行低速离心（如5000 x g，1分钟），取上清液使用。

• 检查管盖螺纹处是否有晶体析出，若有，说明蒸发严重，此管Marker已不宜用于精确定量分析，但仍可用于粗略定性观察。后续保存务必严密包裹封口膜。

问题十一：进行荧光Western Blot（直接标记荧光二抗）时，发现Marker的蓝色通道产生了强的串扰（Cross-talk），掩盖了真实信号。

深度剖析： 蓝色染料的最大激发/发射波长可能与某些常用荧光基团（如Cy5， Alexa Fluor 647等远红光染料）的激发光谱存在重叠。

解决对策： 

• 在设置荧光扫描仪的参数时，先单独扫描Marker通道（如Cy2或FITC通道观察蓝色），记录位置后，关闭该通道，再扫描目标蛋白的远红通道。

• 后期使用图像处理软件将Marker通道作为Overlay（叠加层）导入，手动对齐，而不是直接在同一张多色荧光图中分析。

问题十二：怀疑Marker本身携带的生物素（Biotin）或Strep-tag影响了实验结果。

深度剖析： 部分版本的Protein Standards可能带有特定的多肽标签（如Strep-tag II）以便于后续的特异性检测。如果实验体系中使用了链霉亲和素（Streptavidin）或抗Strep-tag抗体，就会发生高背景结合。

解决对策： 

• 查阅本产品的技术参数表（Technical Datasheet）。确认1610374是否含有此类标签。

• 若确实含有，且您的实验涉及亲和素-生物素系统，则必须更换为不含任何标签的普通预染Marker（如Bio-Rad的Kaleidoscope标准品，货号1610375）。

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（注：本文内容基于品牌公开资料及行业常规信息整理，具体以品牌信息文档为准。）

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