Diagnostic BioSystems（K074）PermaGreen™/HRP 底物–色原系统说明书

一、产品描述

商品名称（中文可称）：PermaGreen™/HRP 底物–色原系统（亦称：PermaGreen™ HRP 绿色显色底物系统）

英文原名：PermaGreen™/HRP Substrate-Chromogen System for Horseradish Peroxidase (HRP)

品牌/生产商：Diagnostic BioSystems (DBS)，总部地址 6800 Sierra Court, Pleasanton, CA 94566, U.S.A.

产品分类：IVD（体外诊断用途）—— Chromogens for HRP（辣根过氧化物酶用色原）/ Chromogens 大类

目录号（Catalog No.）与规格：

• K074 —— 基础规格套装（Substrate Buffer 30 mL × 1瓶 ＋ Chromogen 30 mL × 1瓶 ＋ 空混合瓶 × 1个），适用于常规实验室日常用量

• K074-110 —— 大体积规格套装（Substrate Buffer 110 mL × 1瓶 ＋ Chromogen 110 mL × 1瓶 ＋ 空混合瓶 × 1个），面向高通量染色平台或集中化检测实验室

以上实际液体体积均以瓶身标签标注为准，不同批次的外包装文字可能有微小格式差异，请以收到实物标签信息为准。

预期用途（Intended Use）：本产品为 _体外诊断用途（In Vitro Diagnostic Use）_ 的底物–色原系统，设计用于 免疫组织化学（IHC） 与 原位杂交（ISH） 检测流程中，凡检测末端步骤借助 辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase, HRP） 催化显色的实验体系均可配套使用。经反应后在组织切片/细胞制片上产生 明亮的绿色不溶性显色沉淀，并可配合封片剂完成长期保存的封片操作。

配套体系提示：本产品本身不含一抗、二抗、阻断剂或抗原修复试剂等前置试剂，也不含复染液（如苏木素），这些需由使用者根据检测方案自行准备或从 Diagnostic BioSystems 等合规供应商处另行采购。

二、背景与适用场景概述

在传统 IHC / ISH 显色体系中，DAB（3,3′-二氨基联苯胺） 因其产生的棕褐色沉淀不溶于有机溶剂、可封片，长期以来是 HRP 体系中最常见的色原选择。但在某些实验情境下，DAB 的棕褐色会与以下因素产生冲突：

• 组织自身含有 棕褐色色素沉积（如含铁血黄素、部分固定色素残留、某些肿瘤组织中的色素性改变）；

• 实验设计为 多轮/多重染色（multiplex IHC / sequential staining），需要在同一张切片上区分两种或以上靶标，此时需要 光谱上彼此可区分的颜色通道，而 DAB 的棕褐色与多数复染（苏木素蓝紫色）之外的第二色原选择余地有限；

• 阅片者主观反馈 棕色与某些细胞质嗜酸性颗粒灰度接近，希望换用 更醒目的对比色 来降低漏读风险。

在上述背景下，PermaGreen™/HRP 作为一款 绿色通道的 HRP 色原底物系统，提供了 DAB 棕色的替代/并行选项：其阳性信号呈 鲜亮的绿色调，与苏木素（蓝紫/蓝色核复染）形成经典且易于目视分辨的色彩搭配，同时也为多色显色策略提供了可用的颜色维度。

三、产品特点

1. 为 HRP 体系量身设计：本产品不是荧光系统，也不是碱性磷酸酶（AP）体系的色原，而是专用于 HRP 标记检测末端 的化学显色底物–色原组合，可直接衔接在 polymer–HRP、streptavidin–HRP、直接 HRP 偶联一抗等各类常见 IHC/ISH 检测架构之后使用。

2. 产生明亮的绿色不溶性产物：在 HRP + H₂O₂ 存在条件下，色原组分被氧化并与底物缓冲体系协同，在组织/细胞上的抗原（或探针靶位）处沉积出 绿色显色沉淀，肉眼及常规明场光学显微镜（10×–40× 常用倍率）下可清晰辨识。

3. 可封片保存：阳性信号形成的显色产物适合用常规封片剂（如合成树脂类封片介质）封固，便于切片归档、复核及长期储存。（具体操作建议见后文「使用方法」章节中的封片注意事项。）

4. 工作液稳定窗口明确：按厂家 datasheet（Document # DS-4026-E，Effective Date 2017/03/07），配制后的工作液在避光条件下具备 至少约 4 小时 的有效工作时间，既支持手工逐张滴加，也支持自动化染色仪一次性加载运行。

5. 兼容自动化与手工操作：无论实验室使用的是全自动 IHC 染色平台，还是半自动/纯手工染色流程，本产品均可通过 预混单液模式 或 机上分别装载后按 1:50 在线混合模式 灵活接入现有 SOP，无需对仪器硬件做特殊改造。

6. 绿色与常见复染对比清晰：绿色阳性信号与 苏木素（Hematoxylin）蓝紫色细胞核、或与某些 甲基绿/核快红 等复染方案均可形成良好反差，有助于提升阳性定位的直观性——尤其在低表达强度区域或组织形态复杂区域，绿色相对于棕色有时能提供不同的视觉判读线索（具体仍以各实验室验证为准）。

四、储存条件与运输/操作注意事项

4.1 推荐的储存条件

• 未开封试剂：应储存于 2 °C – 8 °C（冰箱冷藏），并 避光保存。切勿冷冻（冷冻可能导致组分沉淀、分层或活性下降）。

• 每次取用后应立即盖紧瓶盖、放回冷藏环境，减少光照暴露和冷凝水进入。

• 不要使用超过瓶身/标签所印有效期（expiration date）的产品。若试剂未按指定条件储存（例如长时间暴露于室温、光照直射、反复温差循环），使用者须在使用前自行验证其性能是否仍满足检测要求，必要时更换新批号。

4.2 工作液的临时存放

• 配制好的 PermaGreen™/HRP 工作液对光敏感：应尽量在 避光或半避光条件 下配制、转移和使用（例如在棕色瓶、铝箔包裹的容器或带遮光盖的试剂槽中操作）。

• 工作液建议在配制后 尽快使用，厂家给出的稳定窗口约为 最长 4 小时（室温下避光），为获得一致的染色强度，推荐每次现配现用，而不是长时间存放后继续补用。

4.3 一般实验室安全注意事项

• 本试剂可能引起刺激，避免接触眼睛、皮肤和黏膜。操作时建议佩戴合适的个人防护装备：实验服/白大褂、丁腈手套、防护眼镜；若在开放台面大量配制或分装，建议在化学通风橱内进行。

• 如试剂意外接触眼睛，应以大量清水持续冲洗数分钟并就医评估；如皮肤接触，用肥皂和水清洗。

• 涉及人体或动物来源组织的 IHC/ISH 全流程本身应按 潜在生物危害材料 管理：所有切片、废液、刀片、涂片均应按规定高压灭菌/消毒后再按医疗废物处置。

• 废弃试剂处置请遵循所在机构、当地及国家的化学品/生物医学废物管理法规。

五、工作原理（生化机制概述）

5.1 HRP 显色体系的基本逻辑

无论前端检测架构是 多聚体 HRP 二抗系统（polymer–HRP）、链霉亲和素–HRP（Streptavidin–HRP）、还是其他能将 HRP 锚定到抗原位点的方案，在洗涤去除未结合的检测试剂后，切片上的 阳性位点 = HRP 富集位点。

HRP 在微量 H₂O₂ 存在时可催化其底物发生氧化反应；当体系中同时存在一类可被氧化并形成 不溶性沉淀 的色原分子时，氧化产物会在 HRP 所处的微环境中沉积下来，从而形成 位置特异的显色信号——这就是经典 IHC/ISH 化学显色检测的核心原理。

5.2 PermaGreen™/HRP 在本体系中的角色

PermaGreen™/HRP 系统由两个关键组分构成（对应 K074 / K074-110 盒内分瓶）：

• PermaGreen™/HRP Substrate Buffer（底物缓冲液）：提供适宜 pH / 离子强度的反应环境，其中含适量 H₂O₂（或在反应体系中保证 HRP 所需的氧化驱动力），使 HRP 处于可催化状态；

• PermaGreen™/HRP Chromogen（色原溶液）：含有可在 HRP/H₂O₂ 作用下被氧化、并在局部沉积为绿色不溶性产物的发色团前体。

当两者按一定比例混合后（见下文使用方法），即形成 工作液：此时色原前体与底物缓冲中的其他组分共存，一旦工作液接触到切片上结合了 HRP 的区域，HRP 催化氧化–沉淀反应便在数分钟内发生，阳性位点逐渐显现 绿色沉积，而无关背景区域因缺乏 HRP 而不会产生显著着色（前提是内源性过氧化物酶已被充分淬灭、操作条件合理）。

5.3 为什么能「封片」

与某些水性封片体系（例如 AEC 的红色产物可溶于有机溶剂，只能用水性封片剂、长期易褪色）不同，PermaGreen™/HRP 的氧化沉积产物在设计上趋向于 对后续脱水/透化步骤更稳定（但仍建议严格按后文推荐的封片路径操作，例如优先选择空气干燥后封片的方式，以避免个别溶剂体系导致信号减弱，具体情况以实验室验证为准）。这也是其适用于诊断归档和长期保存的关键属性之一。

六、本产品旨在解决的实验痛点

这里不用表格——改为段落阐述

在实际 IHC / ISH 日常工作中，我们常遇到以下几类「显色端」问题，而 PermaGreen™/HRP 正是从色原维度提供一种可行解法：

（1）DAB 棕色与组织固有色素/固定色素难以区分

某些组织（如含陈旧出血灶、含铁血黄素沉积、脂褐素、某些色素性肿瘤）本身就带有黄褐/棕褐色调，此时 DAB 阳性信号可能被低估甚至误判为阴性。改用绿色色原后，阳性信号色调和组织色素色落在不同色谱区间，可为病理医师/阅片者提供更容易区分的视觉参照。

（2）多重 IHC / 序贯染色需要第二（或第三）颜色通道

当实验目标是在同一张切片上做两个蛋白标记（例如一个增殖指标 ＋ 一个谱系标记），若第一标记已经用了 DAB 棕色，第二标记就需要一个在明场下明显可分、且不影响沉淀稳定性的另一颜色——绿色是一个合理的候选，只要其化学沉积机制不与第一轮的沉积互相干扰（具体可行性需用户根据自身抗体方案验证兼容性）。

（3）部分使用者希望减少对「苯嗪类」经典色原的心理/管控顾虑，寻求多样化色原储备

虽然 DAB 在规范操作下有成熟的实验室管控经验，但部分机构出于试剂清单管理偏好，也希望保留 非棕色的替代色原 作为可用选项。PermaGreen™/HRP 属于这类可选库中的绿色分支。

（4）自动化平台加载稳定性的实际诉求

在小批量手工实验中，「现配现滴」很容易；但在全自动染色仪上，试剂往往需要提前加载、在机上待命一段时间。PermaGreen™/HRP 的工作液具备 至少约 4 小时的稳定窗口，使其更适合作为仪器可调用的显色试剂之一，减少频繁中断加液。

七、使用方法（详细操作流程）

⚠️ 重要：以下内容基于 Diagnostic BioSystems 品牌 datasheet（DS-4026-E）中给出的标准操作框架整理，并结合 IHC/ISH 行业常规做法补充说明。实际最佳孵育时间、洗液配方、封闭条件、抗原修复参数、复染种类等均取决于用户所用的一抗、检测系统及组织类型，请务必通过阳性/阴性对照切片对条件做验证后再用于正式样本。

7.1 使用前准备（Preparation Before Use）

盒内通常包括：

• PermaGreen™/HRP Substrate Buffer（不透明瓶或琥珀色瓶封装，需冷藏避光）

• PermaGreen™/HRP Chromogen（同样需冷藏避光）

• 1 个空混合瓶（用于配制工作液）

你需要自行准备的配套物品（不在本盒内）：

• 已完成 脱蜡至水 → 抗原修复 → 内源性过氧化物酶淬灭 → 一抗孵育 → HRP 检测系统孵育 → 洗涤 步骤的组织切片（贴附于载玻片、已进行必要阻断和洗涤）

• 免疫组化用洗涤缓冲液（如 PBS / TBS ＋ 适度 Tween-20，依你 SOP）

• 复染液（常用：Hematoxylin 苏木素），以及复染后蓝化液（如流水返蓝或 Scott's Tap Water Substitute，视方案而定）

• 封片剂（如合成树脂封片介质 / ImmunoHisto-Sealer 类产品——DBS 也提供 K076 ImmunoHisto-Sealer 作为可选配套）

• 移液器、黄/蓝吸头、铝箔（用于遮光）、计时器

7.2 工作液配制（Working Solution Preparation）

标准配比（手工/预混）：

1. 取干净容器/提供的空混合瓶，先加入 1 mL PermaGreen™/HRP Substrate Buffer。

2. 向其中加入 1 滴（约 20 µL） PermaGreen™/HRP Chromogen。（部分自动化平台的文档中也用 1:50 的 Chromogen : Buffer 近似比例关系 来描述相对用量——即约 1 份 chromogen 对 50 份 buffer。）

3. 换上新枪头轻混均匀（避免剧烈产生气泡）。

4. 若溶液较冷，允许其在遮光条件下达到室温后再上机/上片使用。

关键注意：

• 配制全过程 尽量减少光照（可把混合瓶裹一层铝箔，或在抽屉/遮光盒内短暂放置）。

• 配好的工作液 应在约 4 小时内使用完毕；如果观察到溶液本身出现明显变色（例如还没接触切片就泛绿/浑浊沉淀），说明可能已经自氧化或污染，不建议继续使用。

• 每次实验批次建议新鲜配制，不要为了省事把隔夜的工作液继续用于诊断切片。

7.3 染色步骤（Staining Procedure）

假设你的切片已经走完「一抗 → HRP 检测试剂」并已做过充分洗涤：

（A）手工操作（Manual Use）

1. 末次洗涤：按你现有 SOP 完成 HRP 检测系统孵育后的洗片（通常 TBS/PBS 洗 2–3 次，每次 2–5 分钟）。

2. 显色：将 freshly prepared 工作液直接滴加/覆盖到切片组织区域（用量以刚好覆盖不干涸为准），室温（或你验证好的温度）孵育 约 5–10 分钟。期间可在显微镜下抽检一张切片，观察绿色信号出现的速度与背景状态，据此微调最终时间。

3. 停显：当信号强度满意后，将切片迅速浸入去离子水 / 洗涤缓冲液中终止反应（避免持续催化导致背景加深）。

4. 复染：按常规进行苏木素复染（典型 30 秒–数分钟，取决于苏木素配方与实验室习惯），然后流水返蓝/蓝化液处理。

5. 封片：PermaGreen™/HRP 的绿色沉淀适合封片；DBS 在其姊妹产品说明中也强调：推荐将切片水洗后 air dry（空气中干燥），再封片，以减少不必要溶剂暴露带来的风险（具体封片介质请依据你实验室已有合格产品验证）。

（B）自动化平台——预混单液加载（Pre-Mix Working Solution）

• 在工作液稳定窗口内（≥ 4 h），你可以把它当作 单一显色液 加载到仪器的相应试剂位上；同样 注意遮光（部分仪器试剂仓本身较暗，但如有透明管/开放托盘，建议铝箔遮蔽）。

• 仪器程序中的显色孵育一般设 5–10 min，具体需以你平台手册与验证结果为依据。

（C）自动化平台——机上分别装载、在线 1:50 混合（On-Board Mixing）

• 若仪器具备 onboard mixing 站，可将 Buffer 和 Chromogen 作为独立两通道分别加载，由仪器按比例（大致 1:50 关系）在临用前混合，再施加到切片上，孵育同样 5–10 min。

7.4 质控与对照设置建议

• 阳性对照：每次运行应包含已知表达靶标的组织，确认绿色信号在正常表达区出现且强度合理。

• 阴性对照：可用同型IgG替代一抗、或省略一抗的步骤作为背景参照，确认绿色沉淀不会在无靶位处系统性出现。

• 若你做的是 多重染色（第一轮 DAB → 第二轮 PermaGreen/HRP），还需额外验证第一轮沉积在第二次抗体/检测系统孵育过程中是否会被非特异性叠加染色（这是 multiplex 明场方案的通用药学–组织学考量，需逐方案验证）。

八、故障排除 / 常见问题与解决方案（Troubleshooting）

以下按「现象 → 可能原因 → 处理方向」逐条展开：

8.1 镜下几乎没有绿色信号（假阴性倾向）

可能原因①：一抗失败 / 抗原修复不匹配 / 靶标确实阴性

→ 先跑阳性对照切片：若阳性对照也无绿色，问题在上游而非 PermaGreen 本身。检查抗原修复 pH/温度/时间、一抗稀释度与批次、是否存在过度固定导致的表位遮蔽。

可能原因②：HRP 检测系统未正确结合（polymer 失效/二抗种属不对/Streptavidin–HRP 步骤遗漏）

→ 检查检测试剂盒说明书的种属匹配关系；确认孵育时间/温度；确认洗涤是否过猛（水流直冲组织可物理脱层）；确认 polymer 是否过期或反复回温。

可能原因③：内源性过氧化物酶淬灭过度？不，这通常导致背景升高而非信号消失；但若你在 HRP 检测系统之后、显色之前又加了强还原剂/漂白步骤就会毁掉 HRP。

→ 确保显色前不要让切片接触含叠氮钠（NaN₃）的高浓度溶液或强氧化剂/强还原剂体系。

可能原因④：工作液失效（放太久/光照自氧化/配比错）

→ 确认配制比例（Buffer 主体 ＋ 1 滴 chromogen 约 20 µL 每 mL），确认从配制到使用不超过约 4 h，全程尽量避光。若 Buffer 或 Chromogen 本身已变色/浑浊/有沉淀，应废弃换新批。

8.2 整个切片（包括空白区）弥漫淡绿色或非特异性绿色沉积（背景/假阳性）

可能原因①：内源性过氧化物酶淬灭不充分

→ 大多数福尔马林固定石蜡切片在显色前需要用 H₂O₂（常用 0.3%–3%，依方案） 预处理以灭活内源 HRP（时间通常 10–15 min）。若组织类型富含红细胞（含假过氧化物酶活性），可能需要更强阻断方案（如温和酸/乙醇–H₂O₂ 变体，需验证组织耐受性）。

可能原因②：抗体非特异性结合（一抗浓度过高/组织未充分封闭/洗涤不足）

→ 优化一抗滴定曲线；引入合适封闭血清（如正常 serum from 二抗宿主 species）；增加洗液体积与换液次数；确保洗液 pH 稳定（TBS 通常 pH 7.4–7.6）。

可能原因③：显色时间太长

→ 绿色信号随时间增长会逐步加深，但背景也可能爬升。建议做时间梯度（5 / 7 / 10 min）在镜下监控，找到「信号达标但背景可接受」的最短稳健时间。

可能原因④：工作液被污染（枪头碰触切片后回蘸/瓶口交叉污染）

→ 永远不要把接触过切片的枪头/液体倒回试剂瓶。工作液最好分到一次性槽/皿中使用。

8.3 信号极不均匀：部分区域绿色很深、相邻区域同类型细胞却几乎无色

最常见原因：组织干燥（edge drying / partial desiccation）

→ IHC 中任何一步让切片表面局部干涸都会导致抗体或酶分布不均，显色后呈现斑驳/花边样差异。确保所有孵育都在湿盒中进行，覆盖液量足够，避免边缘效应。

另一个原因可能是 固定不均匀（大标本中心与表层固定速率差异）→ 这属于样本前处理范畴，色原端无法单独纠正。

8.4 绿色信号在封片后褪色或变浅

• 确认你使用的是 封片剂（树脂类），并确认封片前切片已按推荐方式处理好（部分方案中建议空气干燥后再封，而不是强行走完醇/二甲苯序列——尤其如果你的实验室所用溶剂体系未经此色原验证的话）。

• 若你发现某特定商业封片剂导致变色，可换用另一种经内部验证的合成树脂封片介质做对比试验。

• 避免日光直射存档——所有染色切片长期保存原则上都应避光、干燥、恒温。

8.5 「绿色」看起来偏黄/灰，不够鲜亮

这通常与三个因素有关：

1. 复染过深：苏木素时间太长或返蓝不足，核呈近黑色时会"压住"绿色明亮度。适当缩短复染时间或优化返蓝步骤通常有帮助。

2. 显色不足：孵育 <5 min 可能信号太弱而显得"脏"。拉到 7–10 min 区间再做判定。

3. 显微镜光源/滤片/白平衡：卤素灯老化、光圈不当、相机自动白平衡把绿色"校灰"都会造成视觉偏差。建议用标准 Koehler 照明校光后再判读，并保留一致拍照参数。

关键词：PermaGreen HRP 色原, IHC绿色色原试剂盒, 免疫组化绿色显色底物, DBS PermaGreen K074, Diagnostic BioSystems 色原试剂, HRP绿色底物显色系统, IHC双标染色绿色标记, 免疫组化封片绿色染料, 石蜡切片IHC染色试剂, 原位杂交ISH显色底物, K074 K074-110 绿色色原, 免疫组化色原DAB替代方案, 绿色色原vs DAB棕色对比, 免疫组化多色染色方案, HRP chromogen substrate system, 亮绿色不褪色IHC染色, IVD体外诊断用色原, 病理科IHC染色试剂, 免疫组化检测试剂盒配套色原, 苏木素复染绿色阳性信号

更多产品信息，请联系中国区域代理商：上海起发实验试剂有限公司

（注：本文内容基于品牌公开资料及行业常规信息整理，具体以品牌信息文档为准。）

🔖热卖产品