ZeptoMetrix 0801182人IgG ELISA试剂盒中文说明书与实验操作指南

一、产品描述

货号：0801182

英文名称：IMMUNO-TEK™ Human IgG ELISA（96 Determinations）

中文名称：IMMUNO-TEK 人免疫球蛋白G（IgG）酶联免疫吸附检测试剂盒

品牌：ZeptoMetrix（美国）

规格：96孔测定量（96 Determinations），含1块可拆条96孔微孔板及配套试剂

产品类别：酶联免疫吸附 assay（ELISA）定量检测试剂盒

注册/合规属性：仅供科研使用（FOR RESEARCH USE ONLY），不用于体外诊断流程

适用样本类型：人血清、血浆、杂交瘤细胞培养上清、腹水及其他生物体液

保存条件：全部试剂于2–8℃冷藏保存，严禁冷冻

发货配置：产品随箱附带供应商检验报告（Certificate of Analysis，CoA）

本产品用于对人源IgG进行定量测定。试剂盒采用预包被微孔板与即用型试剂，实验人员可在较短时间内完成样本处理、孵育、显色与读数。该产品在单克隆抗体研发、细胞株筛选、纯化工艺监测、免疫学研究等场景中可作为常规检测工具使用。

试剂盒内的微孔板已包被多克隆抗人IgG抗体，捕获相与检测相针对人IgG各亚类进行了平衡设计，可对人IgG主要亚类产生较为一致的反应信号，便于在不同实验批次间进行比较。

二、试剂盒组成

1×96孔微孔板：微孔板条表面包被纯化山羊抗人IgG抗体，用于捕获样本中的人IgG。

检测抗体（Detector Antibody）：12 mL，辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗人IgG多克隆抗体。

人IgG标准品（Human IgG Standard）：7 mL，含人IgG及 assay diluent，用于建立标准曲线。

检测稀释液（Assay Diluent）：100 mL，含PBS、Triton X-100及2-氯乙酰胺，用于标准品稀释与样本稀释。

微孔板洗涤缓冲液（Plate Wash Buffer）：125 mL浓缩型清洗液，含PBS、Tween 20及2-氯乙酰胺，使用前需按说明稀释。

底物液（Substrate）：12 mL，含四甲基联苯胺（TMB），用于酶促显色反应。

终止液（Stop Solution）：12 mL，专用配方，用于终止显色反应。

封板膜：1包，含10张，用于孵育过程中覆盖微孔板。

密封袋：1个，用于暂存未使用的微孔板条。

随货文件：产品说明书及CoA检验报告。

需要另行准备的耗材与设备包括：移液器及适配吸头、单道与多道移液器、离心管与试管架、蒸馏水或无核酸酶纯水、37℃±1℃温箱、酶标洗板机或真空吸液装置、450 nm酶标仪、计时器、防护手套与实验室常规安全防护用品。

三、产品特点

预包被设计：微孔板已完成抗体包被，减少用户自行包被带来的批间差异。

即用型试剂：检测抗体、底物、终止液、稀释液等以可用形态提供，降低配制复杂度。

覆盖IgG主要亚类：捕获抗体与检测抗体针对人IgG各亚类做了平衡，适用于混合亚类样本检测。

样本适应性强：可用于血清、血浆、杂交瘤上清、腹水及其他生物体液中的人IgG定量。

适合单抗工艺监测：在human monoclonal antibody生产与纯化过程中，可用于跟踪抗体表达水平与纯化回收情况。

高通量：96孔板结构适合同时处理标准曲线、空白对照、重复样本与多个待测样品。

操作周期相对可控：标准流程可在两小时内完成，适合项目周期较紧的研发与质控安排。

结果可量化：通过标准曲线计算样本中IgG浓度，便于记录、统计与批次比较。

组分完整：从捕获、检测、洗涤到显色终止的主要试剂均随盒提供，便于实验室标准化管理。

四、储存与运输条件

未开封试剂盒所有组分应存放于2–8℃环境中，避免光照、高温与冷冻。

微孔板条如不一次性用完，应将剩余板条放回原密封袋，排尽空气后封口，置于2–8℃保存。

洗涤缓冲液为浓缩液，使用前需用蒸馏水或无离子水按1:10比例稀释，混匀后使用；稀释后的1×洗液可在2–8℃保存约一周。

底物液应避免长时间暴露于光下，使用后及时盖紧。

终止液具有腐蚀性风险，应单独存放，避免与皮肤、眼睛及金属器械直接接触。

试剂开瓶后应注意标记开瓶日期，避免不同批次试剂混用。

试剂盒运输过程建议维持冷藏条件；到货后应检查包装完整性、试剂泄漏情况及标签有效期。

所有试剂不得冻存，冻结可能破坏抗体活性、酶活性和微孔板包被稳定性。

五、工作原理

本试剂盒基于双抗体夹心ELISA原理，对人源IgG进行特异性捕获与酶促显色检测。

第一步为捕获。微孔板表面预先包被山羊抗人IgG多克隆抗体，作为固相捕获相。加入样本或标准品后，样品中游离的人IgG会与孔壁上的捕获抗体结合，形成“固相抗体–抗原"复合物。

第二步为检测。洗去未结合物质后，加入HRP标记的抗人IgG检测抗体。该二抗与人IgG另一位点结合，形成“捕获抗体–IgG–酶标检测抗体"的夹心结构。

第三步为显色。再次洗涤去除游离酶标抗体后，加入TMB底物。HRP可催化TMB发生颜色反应，使孔中液体由无色逐渐转为蓝色，其显色强度与孔内结合的IgG含量呈正相关。

第四步为终止与读数。加入终止液后反应停止，颜色由蓝转黄。使用酶标仪在450 nm波长下读取吸光度（OD值）。以标准品浓度与其对应OD值建立标准曲线，再根据待测样本OD值计算其中人IgG浓度。

由于捕获抗体与检测抗体均针对人IgG设计，并对IgG主要亚类具有较均衡反应，因此该方法适用于总IgG水平的相对定量与工艺监测。

六、本产品可解决的实验问题

在杂交瘤筛选、人源单抗开发、细胞培养工艺优化和纯化验证中，研究人员常需要判断培养体系中是否有人IgG表达、表达量是否稳定、纯化步骤是否去除杂质以及不同批次间结果是否可比。本试剂盒可提供一套标准化定量思路。

对于血清与血浆样本，该产品可用于免疫学研究中的体液免疫水平观察、动物模型免疫响应评估以及治疗性抗体药代研究中的辅助定量。

对于杂交瘤细胞上清，试剂盒可帮助判断克隆分泌能力，筛选高表达株系，并监控传代、补料、诱导条件改变后的产量波动。

对于腹水样本，可辅助评估抗体含量，为后续纯化倍数、回收率和工艺放大提供数据支持。

对于纯化中间产物，可用于监测亲和层析、离子交换、超滤等步骤前后IgG浓度变化，判断纯化效率与损失环节。

对于方法学建立，该产品提供完整标准曲线体系，可减少自建ELISA中包被条件、二抗浓度和显色时间不一致带来的误差。

七、样本处理建议

血清样本：血液采集后室温静置凝固，随后离心取上清；避免溶血严重或反复冻融的样本。

血浆样本：根据实验需要选择适宜抗凝剂，充分混匀后离心分离血浆上清。

杂交瘤上清：培养结束后离心去除细胞碎片，可取上清直接检测；浓度过高时需用 Assay Diluent 进行适当稀释。

腹水样本：离心去除沉淀与絮状物，必要时进行梯度稀释后测定，避免基质效应造成信号饱和。

其他生物体液：需根据粘度、蛋白背景和潜在抑制因素进行预稀释与回收率验证。

所有样本建议设置复孔，并记录稀释倍数。若样本浓度超出标准曲线上限，应以检测稀释液进一步稀释后重新测定，并将结果乘以稀释倍数。

八、标准曲线制备

人IgG标准品原液浓度通常为125 ng/mL。可使用检测稀释液进行倍比稀释，建立如下梯度：

第1管：125 ng/mL  

第2管：62.5 ng/mL  

第3管：31.25 ng/mL  

第4管：15.6 ng/mL  

第5管：7.8 ng/mL  

第6管：0 ng/mL，作为空白对照

实际操作中可按以下方式配制：取6支试管，第1管加入1000 μL标准品原液；从第1管取500 μL加入500 μL稀释液得到第2管；依次类推，每次取上一浓度500 μL与500 μL稀释液混合，直至第5管；第6管仅加入500 μL检测稀释液作为零点。

标准曲线每个浓度建议设复孔，以减少加样误差对拟合结果的影响。

九、使用方法

1. 实验前准备

将试剂盒组分从2–8℃取出，按实验室操作习惯平衡至适宜温度，但避免长期放置于室温。

检查微孔板是否干燥、封膜是否完整，试剂瓶标签是否清晰。

将浓缩洗液按1:10稀释，混匀后作为1×洗液使用。

准备好标准品稀释管、样本稀释管、移液器、吸头、废液收集容器与计时器。

设定温箱至37℃±1℃，并提前开启酶标仪进行预热与波长校准。

2. 加样

将所需微孔条放入板框，记录孔位布局。

分别加入标准品、空白对照与稀释后样本。

每个孔加入检测抗体工作液，覆盖孔底液面。

注意每加一个样本更换一次吸头，避免交叉污染。

3. 孵育

加盖封板膜，置于37℃±1℃温箱中孵育。

孵育过程中避免震动，保证孔内液体均匀接触包被表面。

严格按统一时间控制孵育时长，不同孔位不要先后相差过大。

4. 洗涤

弃去孔内液体，使用1×洗液充分洗涤。

可采用自动洗板机，也可手动甩干并结合拍板吸液。

洗涤次数与浸泡时间应保持每孔一致，避免残留液体影响背景。

最后一次洗涤后，将孔内残液拍干，但不要让板底全干裂。

5. 显色

加入TMB底物液，避免气泡。

避光孵育，使显色反应稳定进行。

观察颜色变化，标准品高浓度孔应先出现明显蓝色，空白孔应保持较浅底色。

6. 终止与读数

按统一顺序加入终止液，轻轻混匀。

溶液通常由蓝转黄，此时应尽快完成读数。

使用酶标仪在450 nm读取OD值，建议记录参考波长作为背景校正。

7. 结果计算

以标准品浓度为横坐标、对应OD值为纵坐标绘制标准曲线。

采用四参数拟合或线性拟合时，应根据曲线形态选择合适模型。

根据样本OD值在标准曲线上查找浓度，再乘以实际稀释倍数，得到原始样本IgG浓度。

对异常孔、气泡孔、边缘效应孔应进行复测或剔除说明。

十、实验设计建议

每个样本建议设置不少于两个复孔，重要样本可设置三复孔。

每次实验均应包含完整标准曲线、空白孔与阴性对照。

若进行工艺监测，应同步设置阳性参考品或历史批次对照，便于跨批次比较。

细胞上清、腹水与血清基质不同，不可直接套用同一稀释倍数，应通过预实验确定线性稀释区间。

建议记录每次实验的批号、板号、温箱温度、洗板次数、显色时间与读数参数，形成可追溯数据档案。

十一、常见问题与解决方案

1. 背景偏高或空白孔颜色深

可能原因包括洗涤不充分、底物污染、终止前反应时间过长、洗液残留过多或微孔板受潮。

解决方案：增加洗涤体积与次数，确保每孔洗液全吸净；检查底物瓶是否污染；统一显色时间；未使用的板条继续密封防潮保存。

2. 标准曲线拟合不好

可能原因是标准品稀释误差、加样体积不准、孔间气泡或拟合模型不合适。

解决方案：使用校准移液器，稀释过程充分混匀；加样前排除枪头气泡；优先尝试四参数逻辑拟合，并在标准曲线有效区间内报告样本结果。

3. 样本读数超出标准曲线上限

通常说明样本中IgG浓度较高，存在信号饱和。

解决方案：提高样本稀释倍数后重新测定，结果乘以对应稀释倍数。不建议直接外推标准曲线两端以外数据。

4. 显色过慢或信号偏弱

可能与试剂未充分平衡、孵育温度偏低、酶标抗体活性受影响或加样量不足有关。

解决方案：确认温箱达到37℃±1℃；检查试剂是否过期或反复冻融；保证加样体积一致；避免底物长时间放置后污染。

5. 孔间重复性差

常见来源为加样速度不一致、洗板压力不均、微孔边缘蒸发或移液误差。

解决方案：优先使用多通道移液器；避免板边缘长时间敞开；将重要样本安排在板中部；对CV过高的孔进行复测。

6. 边缘孔结果异常

可能存在边缘效应，即板边水分蒸发、温度分布不均导致显色差异。

解决方案：边缘孔设置空白或对照；封板膜贴紧；温箱预热稳定；必要时在边缘孔加入等量缓冲液作平衡孔。

7. 样本基质干扰导致回收率偏低

高粘度腹水、浓缩纯化液或复杂培养基可能抑制免疫反应。

解决方案：进行回收率实验；增大稀释倍数；更换稀释液体系；通过spiking实验验证基质影响。

8. 不同批次结果难以比较

可能受标准品、孵育时间、读板时间和曲线拟合方式影响。

解决方案：固定操作流程；保留历史阳性对照；同一项目尽量使用同批试剂；跨批比较时注明批号与拟合方法。

9. 微孔板条剩余后活性下降

多因保存不当、受潮或封口不严造成。

解决方案：未用板条立即放回原袋，排尽空气后密封；避免手指直接接触包被面；不要将板条长时间暴露于室温。

10. 终止后颜色不稳定

可能与终止液加入不均、读数延迟或光照有关。

解决方案：终止后轻柔混匀；按固定顺序加终止液并尽快读板；若无法立即读数，应记录延迟时间并尽量保持各板一致。

十二、安全与操作注意事项

本产品仅供科研使用，不用于临床诊断、治疗或体外诊断流程。

操作时应穿戴实验服、防护手套与护目镜，遵循实验室生物安全规范。

样本可能具有潜在感染性，应按生物危害废弃物处理。

终止液可能含酸性成分，避免接触皮肤、眼睛与衣物；如不慎接触，应立即用大量清水冲洗并寻求医疗帮助。

试剂不可食用，不可用于非指定实验体系。

避免不同试剂盒试剂混用，以免影响批间一致性。

若试剂出现浑浊、严重沉淀、泄漏或标签损坏，应暂停使用并与供应方确认。

实验废弃物应按照当地生物安全与化学废物管理规定分类处置。

十三、适用研究方向

人源单克隆抗体开发与筛选。

杂交瘤细胞株表达水平监测。

细胞培养工艺优化与补料策略评估。

抗体纯化工艺中间品浓度检测。

腹水与培养上清中IgG含量比较。

免疫治疗、疫苗评价与体液免疫研究中的辅助定量。

重组蛋白表达体系中的人IgG残留或表达监测。

科研数据建档、方法学验证与工艺质量追踪。

十四、性能使用说明

该产品公开资料中常见检测区间约为7.8–125 ng/mL，具体有效范围以当批CoA、标准曲线拟合质量及用户预实验结果为准。

不同样本基质所需稀释倍数差异较大。血清、血浆、杂交瘤上清与腹水均应先做预稀释与线性验证，再用于正式定量。

试剂盒提供的是相对定量平台，结果解释应结合标准曲线质量、复孔变异、稀释线性和实验目的，不宜单独作为诊断结论。

十五、质量控制建议

每次实验设置空白、零标准与至少5个标准点。

记录板内CV与标准曲线R²或拟合误差。

对关键样本设置稀释回收实验。

保留阳性参考品，观察长期批间稳定性。

建立SOP，将温育时间、洗板程序、显色时间和读板波长固定化。

对异常结果实行复测机制，不凭单个异常孔直接下结论。

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（注：本文内容基于品牌公开资料及行业常规信息整理，具体以品牌信息文档为准。）