PEI转染的方法

PEI转染的方法

常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（*转染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说，超螺旋质粒DNA转染效率较高，在转染后24-72小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，β半乳糖苷酶等来帮助检测。后者也称稳定转染，外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。

PEI转染的方法
材料：质粒DNA  指数生长的真核细胞    PEI （聚乙烯亚胺，是线性的）  1×HBS （pH7.4）
配方：  PEI 储存液（100 μM）：称取125 mg PEI 粉末溶解于50 ml 1×HBS （pH7.4）
中， 0.2 μm 滤膜过滤，储存于4℃备用。
1×HBS （pH7.4）： 将8.76 g NaCl 溶解于900 ml 超纯水，加入20 ml 1 M 的
HEPES，调pH 值到7.4，定容至1 L，过滤（0.2 μm 滤膜）后储存于4℃备用。
方法：
1．细胞分盘： 通过胰酶消化收集细胞，用适当的*培养基以4×105 至8×105
细胞/cm2 的密度平铺细胞于60 mm 组织培养皿上（根据实验需要选择培养皿，
使细胞贴壁后所占总面积达到培养皿面积的70-90％）。根据细胞贴壁情况于
含5％ CO2 的37℃温箱中孵育8-24 h,当细胞贴壁*后即可开始转染。转染
前换入2 mL 预热的无血清培养基。
2. 制备PEI-DNA 混合物：以60 mm 组织培养皿用420 μL 反应总体积为例。准
备两支1.5 mL 离心管，一管将质粒DNA（总量2-8 μg 为佳）加入240 μL HBS
中，混匀。另一管中则用HBS 将100 μM 的PEI 储存液稀释成10 μM，充分
混合。然后取180 μL 10 μM PEI 溶液加入含有DNA 的HBS 中，充分混匀后
室温静置20-30 min。zui后将这420 μL 的PEI-DNA 混合液逐滴加入上述单层
细胞的细胞培养基中，轻轻摇动平皿混匀，置于含5％～7％ CO2 的37℃ 温箱
孵育。
注：每次用100 μM 的PEI 储存液前都需要先将其充分混匀，保证所取的
浓度一致。
3. 培养6-10 h 后更换为37℃预热的含有血清的培养基，继续培养，16 h 左右
可以观测到报告基因的表达。

订货信息