D-荧光素钾盐

以下方案是钾盐和钠盐制备的一个例子，它可以适用于大多数细胞类型和体内动物用途。

1.用于体外生物发光图像测定的实施方案

1.1在无菌水中制备100mM（100-200X）荧光素原液。混合均匀。立即使用，或单独使用等分试样，并储存在-20°C，避免冻融循环，避免暴露在光线下。

1.2在预热的组织培养基中制备0.5-1mM D-荧光素的工作溶液。

1.3从培养细胞中分离培养基。

1.4将荧光素工作溶液加入细胞中，并在成像前将细胞在37°C孵育5-10分钟。

2.用于体内生物发光图像测定的实施方案

2.1在DPBS中制备15mg / mL荧光素储备溶液，不含Mg2+和Ca2+。 混合均匀。

2.2过滤器通过0.2μm过滤器过滤灭菌溶液。立即使用，或单独使用等分试样，并储存在-20°C，避免冻融循环，避免暴露在光线下。

2.3在动物体重150mg / kg（或10μL/ g荧光素储备溶液）成像10-15分钟腹膜内（i.p.）注射荧光素。

注意：应对每种动物模型进行荧光素的动力学研究，以确定峰值信号时间。

3.荧光素报告分析分子测定的实施方案

3.1在无菌水中制备100mM荧光素储备溶液。 立即使用，或单独使用等分试样，并储存在-20°C，避免冻融循环，避免暴露在光线下。

3.2制备1mM D-荧光素的工作溶液，其中含有3mM ATP，1mM DTT和15mM MgSO 4的25mM tricine缓冲液，pH7.8。

3.3将5-10μl细胞裂解液移入微孔板中。使用不含裂解液的裂解试剂或缓冲液作为空白。

3.4根据制造商的说明，使用荧光素工作溶液的普利光度计。

3.5注入200μl荧光素工作溶液，无延迟，10秒积分时间。

D-荧光素钾盐溶于无菌水和缓冲液，溶解度可高达25mg/mL。一般使用浓度为3-15 mg/mL。溶液的pH值、溶液中的氧气和保存时间对其保存过程中的稳定性非常重要。当溶液的pH<6.5（发生水解作用）或>7.5（发生消旋化作用，D型转化为L型）的情况下，D-荧光素钾盐相对不稳定。如果溶液中存在少量的氧气，将加速D-荧光素钾的降解速度。储备溶液可以在不含ATP的水中制备，并在-20°C下避光储存。必须用适当的碱中和游离酸溶解。

D-荧光素可与任何现有的文献或ATP分析系统一起使用。

如果检测ATP，请戴上手套并使用无ATP容器，尽量减少所有可能的ATP污染源。仅使用无菌无ATP水和试剂。使用高压灭菌水进行所有试剂制备。