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 技术文章
PEI转染注意要点
点击次数:108 发布时间:2020-01-02

线性PEI转染说明书

PEI转染注意要点  

化学名:线性聚乙烯亚胺,线性PEI,聚乙烯亚胺,线性,MW 25000,转染级

订货号  9002-98-6   规格:1G  品牌:BIOHUB       CAS  9002-98-6,26913-06-4        

分子式:(CH2CH2NH)n      分子量: 25,000      熔点: 73-75º 

溶于:热水,低pH冷水,甲醇和乙醇。    不溶于:苯,乙酉迷和丙酮   

外观:白色至黄色固体       处理手套和通风橱

储存:在室温下避光干燥储存

配置:1:称取100mg线性聚乙烯亚胺,加新鲜的细胞级别的水90ml,加盐酸至PH=3左右, 加热至80℃左右搅拌过夜溶解PEI,

2:用氢氧化钠溶液调整pH值至7.0 ,定容至100ml,用0.22um的滤器过滤,分装后储存于4℃,保质期可以达到12个月。

转染操作流程:

瞬时转染方法  

1. 接种细胞: 转染前一天,用胶原酶(WORTHINGTONG公司LS004196)消化细胞并计数(不建议用胰酶)。调整细胞浓度,将细胞铺入细胞培养的器皿,每个孔置入的细胞量应能使转染时细胞汇合度达到 70~80%。

2. 准备 DNA-PEI 复合物: DNA、PEI 试剂和稀释剂在进行以下步骤前需先使其升至室温。,用 Opti-MEM ITM(Invitrogen)或其他适合的无蛋白培养基稀释适量 DNA。用同样的培养基稀释 PEI 试剂。每 1 μg DNA 需用 1-5 μL 线性PEI转染试剂。一边轻轻涡旋装有 DNA 溶液 的试管,一边将稀释的线性PEI转染试剂滴加至试管中(注意:请勿颠倒添加顺序)。充分混匀后,室温静置 10~25 min 以形成 DNA-PEI复合物。当溶液体积较大时,请用圆底聚丙烯管,例如 NEST  5 mL /14 mL 离心管。

3. 转染细胞: 直接向每个孔中加入 DNA-PEI复合物并轻轻涡旋培养板/培养皿。在无血清条件下转染时,去除生长培养基,替换成无血清培养基,然后滴DNA-PEI复合物。转染 3 h 后,添加½体积的包含 30%血清的生长培养基。

4. 孵育细胞和分析结果: 在 CO2培养箱中 37下孵育细胞至可以分析检测。转染后快 7 h 即可检测到转入基因的表达。 请自行确定适合检测时间。

稳定转染方法

1. 接种细胞: 转染前一天,用胶原酶(WORTHINGTONG公司LS004196)消化细胞并计数(不建议用胰酶)。调整细胞浓度,将细胞铺入细胞培养的器皿,每个孔置入的细胞量应能使转染时细胞汇合度达到 70~80%。

2. 准备 DNA-PEI 复合物: DNA、PEI 试剂和稀释剂在进行以下步骤前需先使其升至室温。依据表 1 所示,用 Opti-MEM ITM(Invitrogen)或其他适合的无蛋白培养基稀释适量 DNA。用同样的培养基稀释 PEI 试剂。每 1 μg DNA 需用 1-5 μL 线性PEI转染试剂(这个需要客户自行摸索配比,每一批转染试剂和每一批DNA比例可能会稍有不同)。一边轻轻涡旋装有 DNA 溶液的试管,一边将稀释的线性PEI转染试剂滴加至试管中(注意:请勿颠倒添加顺序)。充分混匀后,室温静置 10~25 min 以形成 DNA-PEI复合物。当溶液体积较大时,请用圆底聚丙烯管,例如 NEST  5 mL /14 mL 离心管。

3. 转染细胞: 直接向每个孔中加入 DNA-PEI复合物并轻轻涡旋培养板/培养皿。在无血清条件下转染时,去除生长培养基,替换成无血清培养基,然后滴DNA-PEI复合物。转染 3 h 后,添加½体积的包含 30%血清的生长培养基。

4. 孵育细胞和分析结果: 在 CO2培养箱中 37下孵育细胞至可以分析检测。转染后 7 h 即可检测到转入基因的表达。

5.转染 24 h 后,将细胞传代至新鲜的生长培养基中(将细胞稀释 10 倍 以上),在 CO2培养箱中 37孵育过夜。第二天加入与转染抗性基因相匹配的筛选药物。约 1~2 周可 筛选到耐药性克隆,在这期间需经常更换含筛选药物的生长培养基。  

特别提醒

1. PEI 25K含有4-11%的残留丙酰基,这可能阻碍聚合物主链与DNA的有效结合,所以批间转染效率可能会有比较大的差异,建议一个批次可以多购买,PEI 25K稳定性在室温干燥避光下可稳定保存10年以上(虽然有效期标注只有18个月左右)

2. 对于某些类型的细胞如 HEK-293、HEK293T、NIH/3T3 和 COS 细胞,在转染前两天铺板可显著 提高转入基因的表达水平。如果选择转染前两天铺板,可适当降低铺板密度,以确保转染时细胞的汇合度仍为 70~80%。

3. 对于接触抑制敏感的细胞,可适当降低铺板密度。

4. 即使在有蛋白(如 10%的血清)存在的情况下,DNA-PEI复合物仍能转染细胞,但是 DNA-PEI复合物必须在无蛋白存在的条件下形成。我们推荐使用 Opti-MEM ITM 培养基以达到最宜转染效率。其他的无蛋白培养基则需测试与线性PEI转染试剂的兼容性。

5. 对大多数细胞来而言,每 1 μg DNA 使用 3.0 μL PEI转染试剂都能获得较高转染效率。使用 者也可尝试每 1 μg DNA 使用 1~4 μL 体积线性PEI转染试剂进行优化。

6.本手册只是一个基本操作手册,具体转染过程中需要根据实验进行优化,优化方向为混合时间,转染时间,DNA混合比列.......

7.Polyethylenimine, Linear (MW 25,000) 为Polysciences公司生产的化合物产品,每批产品出厂前都经过严格的检测,保证每批产品都100%合格、稳定且高品质,但由于作为转染试剂使用过程中有很多实验室因素(配置方法,PH,水纯度,称量的准度,dna RNA纯度,细胞状态,细胞品系…)造成溶解出现问题或者转染效率出现差异,所以厂家只受理该产品纯度,分子量及重量缺失破损等相关投诉,针对极个别客户溶解问题和转染效率问题我们只能友善解决,所以不能保证您能获得满意答复,对于产品产品转染效率不高,转染批间有差异,转染不了等问题,不作为评价我们售后工作的依据。
    如果我们提供的PEI手册都无法解答您的问题,建议您可以多看文献,多调整一下转染条件,找出适合自己细胞的转染方法。如果无暇摸索条件,您也可以直接购买我们配置好细胞转染液,这样免去您很多烦恼,谢谢理解

8.部分数据参考,本数据来源于网络,不作为售后投诉依据

转染试剂和DNA配比数据

细胞型号

培养基

每孔细

胞数

DNA的量

转染试剂量

和培养基混合 4-6h

293H

DMEM

3×104

0.2µg

0.5µL

DMEM+10%FBS

293FT

DMEM

3×104

0.2µg

0.5µL

DMEM+10%FBS

293E

DMEM

3×104

0.2µg

0.5µL

DMEM+10%FBS

293F

DMEM

3×104

0.2µg

0.5µL

DMEM+10%FBS

COS7

DMEM

1.5×104

0.4µg

0.5µL

DMEM+10%FBS

hela

DMEM

2×104

0.3µg

0.5µL

1640+15%FBS

Caco2

MEM

3.5×104

0.3µg

0.75µL

MEM+10%FBS

BHK21

MEM

2×104

0.2µg

0.5µL

MEM+10%FBS

CHO-DG44

DMEM+HT+pro

2×104

0.5µg

0.5µL

DMEM+HT+pro +10%FBS

RAW264.7

DMEM

3×104

0.2µg

0.5µL

DMEM +10%FBS

MCF7

MEM/NEAA+0.01mg/mL insulin + sodium pyruvat

2×104

0.1µg

0.25µL

MEM/NEAA+0.01mg/mL insulin + sodium pyruvat+10%FBS

SW480

IMDM

3×104

0.4µg

0.5µL

IMDM +10%FBS

MDCK

DMEM

4×104

0.6µg

1µL

DMEM+10%FBS

CHO-K1

IMDM+Pro

3×104

0.2µg

0.5µL

IMDM+Pro +10%FBS

HepG2

DMEM

3×104

0.5µg

0.75µL

DMEM+10%FBS

A549

DMEM

2×104

0.3µg

0.5µL

DMEM+10%FBS

NIH/3T3

DMEM

1.5×104

0.1µg

0.75µL

DMEM+10%FBS

vero

DMEM

3×104

0.3µg

0.75µL

DMEM+10%FBS

sf9

SIM SF

5×104

0.4µg

0.75µL

SIM SF+10%FBS

转染效率

细胞种类

中文名称

PEI 转染效率

HEK293

人胚肾细胞

90%-95%

293-T

人胚肾细胞

90%-95%

CHO-K1

仓鼠卵巢细胞

80%-90%

U251

人源神经胶质瘤细胞

80%-90%

Hela

人源宫颈癌细胞

70%-80%

COS7

猴SV40转化肾细胞

70%-80%

HepG2

人源肝癌细胞

70%-80%

NIH/3T3

小鼠胚胎成纤维细胞

60%-70%

胶质瘤干细胞

人源胶质瘤干细胞

60%-70%

Patu8988

人源胰腺癌细胞

60%-70%

U2OS

人源骨肉瘤细胞

60%-70%

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