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 技术文章
上海起发现货zeptometrix 0801197说明书
点击次数:133 发布时间:2020-04-02

上海起发现货zeptometrix 0801197说明书

Human IgA ELISA (96 Determinations)

CATALOG# 0801197

预期用途

IMMUNO-TEK 人 IgA ELISA 试剂盒是一种快速、使用方便的enzymel油墨i免疫s吸附剂assay (ELISA),设计用于测定血清、血浆、杂交瘤细胞上清液、腹水或其他生物体液中的人 IgA。该试剂盒在监测人单克隆抗体的生产和纯化方面尤其有用。该检测试剂盒含有即用型试剂,运行时间不到 2 小时。

IMMUNO-TEK 人 IgA ELISA 试剂盒仅供研究使用。

检测原理

包被有人 IgA 多克隆抗体的微孔构成了试验的捕获阶段。捕获人 IgA  然后与检测抗体(与辣根过氧化物酶偶联的多克隆抗人 IgA)反应。然后使用四甲基联苯胺作为底物定量测定孔中的酶活性。

试剂

提供的材料:

  • 微孔板(1 x 96 孔):包被有纯化羊抗人 IgA 的板条
  • 检测抗体 (12 mL):含有结合的山羊抗人 IgA 过氧化物酶
  • 人 IgA 标准品 (7 mL):含有人 IgA 和检测稀释液
  • 试验稀释剂 (100 mL):含 PBS,Triton X-100® 2-氯乙酰胺
  • 洗板缓冲液 (125 mL):含有 PBS、吐温 20® 2-氯乙酰胺
  • 底物 (12 mL):含四甲基联苯胺 (TMB)
  • 终止液 (12 mL):专有技术制剂
  • 微量滴定板封口机(1 包):每包 10 个封口机
  • 塑料袋(1 袋):用于储存未使用的微量滴定板条

®Triton X-100 是 Union Carbide Chemicals and Plastics Co.,Inc. 的注册商标。Tween 20 是 Imperial Chemical Industries 的注册商标。

需要但未提供的材料:

· 一次性手套

· 用于制备标本和 IgA 标准品稀释液的试管和试管架

· 经验证的可调式微量移液器,单通道和多通道

· 蒸馏水或去离子水

· 经验证的培养箱,能够维持 37+ 1°C

· 量筒和各种烧杯

· 经验证的酶标仪

· 自动酶标洗板机或手动负压吸引设备

· 计时器

储存

将所有试剂盒试剂储存在 2-8 ℃ 下。请勿冷冻。

注意事项

仅供研究使用。不适用于体外诊断用途。

· 进行试验前,仔细阅读所有说明。

· 处理试剂盒组件和检测标本时,使用通用预防措施。*

· 为避免交叉污染,每份标本使用单独的移液器吸头。

· 检测具有潜在传染性的样本时,应遵守关于生物危害材料处置的所有适用的当地、州和联邦法规。

· 终止液含有盐酸,可能导致严重烧伤。如果接触眼睛或皮肤,立即用水冲洗并就医。穿戴防护服和护目镜。

*MMWR,1988 年 6 月 24 日,第 37 卷,第 24 期,第 377-382、387-388 页

试剂制备

洗板缓冲液:

使用前用蒸馏水或去离子水按 1:10 稀释 10X 洗板缓冲液。充分混合。制备的 1X 洗板缓冲液可在 2-8 ℃ 下储存长达一周。如有需要,可额外订购 10X 洗板缓冲液(ZMC 目录号:0801060)。

人 IgA 标准曲线

标签  6  试管如下所示。 人 IgA 标准品浓度为 125 ng/mL。应按照以下方法用试验稀释剂稀释,以制备标准曲线。

 

试管编号

人 IgA 浓度

人 IgA 标准品体积

试验稀释剂体积

1

125 ng/mL

1000 ml

0 ml

2

62.5 ng/mL

500<unk>l/#1

500 ml

3

31.25 ng/mL

500<unk>l/#2

500 ml

4

15.6 ng/mL

500<unk>l/#3

500 ml

5

7.8 ng/mL

500<unk>l/#4

500 ml

6

0 ng/mL

0 ml

500 ml

 

样本稀释

 

血清和血浆:

人血清和血浆样本通常含有 0.6-4.0 mg/mL 的 IgA。因此,我们建议在检测稀释液中制备样本的 1:40,000 稀释液,用于初始检测。

 

初始检测后,可能需要调整待测抗体溶液的浓度,以获得 125 ng/mL 至 7.8 ng/mL 之间的浓度,用于准确定量。

 

杂交瘤上清液:

来自静止细胞培养物的杂交瘤上清液通常含有 1<unk>g/ml 至 30<unk>g/ml 的单克隆抗体。因此,我们建议在检测稀释液中制备细胞培养上清液的 1:250 稀释液用于初始检测。

当使用来自生物反应器的细胞培养物上清液时,可能需要进一步稀释,因为许多生物反应器能够产生比标准静止细胞培养物更高浓度的单克隆抗体。参考生物反应器提供的技术文献,确定将产生 125 ng/mL-7.8 ng/mL 单克隆抗体浓度的稀释度。

初始检测后,可能需要调整待测抗体溶液的浓度,以获得 125 ng/mL 至 7.8 ng/mL 之间的浓度,用于准确定量。

腹水:

腹水通常含有 1 mg/mL 至 10 mg/mL 的单克隆抗体。因此,我们建议在检测稀释液中制备 1:100,000 的腹水稀释液用于初始检测。

初始检测后,可能需要调整待测抗体溶液的浓度,以获得 125 ng/mL 至 7.8 ng/mL 之间的浓度,用于准确定量。

试验程序

使用前使所有试剂恢复至室温。如上所述制备试剂。标记用于制备标准品和标本样本的试管。如果整个微孔板不用于试验,则从微孔板框架中取出多余的条带,并放入含干燥剂的可密封塑料袋中。密封袋子并在 2-8 ℃ 下储存。

步骤 1:将每个试剂条标记在其末端标签上,以确保在测定过程中试剂条与平板框架分离时的同一性。

步骤 2:指定微孔板上的一个微孔并留空。该微孔将作为基质空白。

步骤 3:  移取 200<unk>l 标准品 #1-6 至两个平行孔中。

步骤 4:  吸取 200<unk>l 各标本至两个平行孔中。

步骤 5:用封板覆膜覆盖微孔板,并在 37 ℃ 下孵育微孔板 30 min。

步骤 6:吸取各微孔的内容物,用 1X 洗板缓冲液洗涤微孔 4 次。用 300<unk>l 1X 洗板缓冲液填充微孔并抽吸,进行清洗。执行 4 次填充/抽吸循环。最终清洗周期后,通过在吸水纸毛巾垫上小心敲击微孔板,彻底吸干微孔板。继续进行直至未观察到可见的洗板缓冲液液滴。

步骤 7:移取 100<unk>l 检测抗体至各标准品和标本孔中。

不得向底物空白孔中加入检测抗体。

步骤 8:用封板覆膜覆盖微孔板,并在 37<unk> 下孵育 30 min C.

步骤 9:按照步骤 6 所述,用洗板缓冲液洗板 4 次。

步骤 10:移取 100<unk>l 底物至包括底物空白孔在内的各孔中。

步骤 11:室温下孵育微孔板 30 min。在含有人 IgA 的孔中会出现蓝色。

步骤 12:移取 100<unk>l 终止液至各孔中。颜色将从蓝色变为黄色。

步骤 13:15 min 内,用酶标仪在 450 nm 处读取各孔的光密度。

预期结果

以下为标准曲线示例,不得用于计算实际样品。由于移液、培养箱温度、酶标仪等原因,可能会观察到不同实验室之间的差异。

 

人 IgA 标准品浓度

450 nm 处的光密度

125 ng/mL

1.969

62.5 ng/mL

1.177

31.25 ng/mL

0.652

15.6 ng/mL

0.358

7.8 ng/mL

0.218

0 ng/mL

0.065

 

结果计算

试验有效性:

· 为使试验有效,0 ng/mL 标准品和底物空白的平均光密度必须低于 0.200。

计算:

  • 使用线性图形纸或计算机程序,绘制 Y 轴上各标准品的光密度与 X 轴上相应标准品浓度的曲线。
  • 然后可以使用直尺手动测定每个稀释标本中的人 IgA 浓度进行外推,通过使用具有线性回归函数的计算机程序或袖珍计算器进行线性回归,或通过使用计算机或计算器再次进行点对点计算。

 

  • 通过用于获得原始标本中人 IgA 最终浓度的稀释因子校正稀释标本值。

程序流程图

 

制备试剂稀释液

 

ê

 

移液器样本和标准品

 

ê

 

在 37º + 1ºC 下孵育 30 min

 

ê

 

洗板

 

ê

 

移液器检测器抗体

 

ê

 

在 37º + 1ºC 下孵育 30 min

 

ê

 

洗板

 

ê

 

移液器底物溶液

 

ê

 

在室温下孵育 30 min

 

ê

 

添加停止溶液,并在 450 nM 下读取

 

 

 

 

 

 

 

仅供研究使用不用于体外诊断用途

 

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