德国凯杰QIAGEN RNeasy Mini Kit (货号 74104) 中文说明书

一、 产品描述

在分子生物学、基因表达分析以及高通量测序等前沿生命科学领域，高纯度、完整性好的总RNA（Total RNA）的提取是后续实验成功的基石。QIAGEN RNeasy Mini Kit 作为全球科研人员广泛认可和信赖的RNA提取金标准产品，为广大用户提供了一种快速、便捷且具重复性的总RNA纯化方案。

本说明书旨在为用户提供关于该产品深层次的解析，从基础的产品信息到深奥的工作原理，再到实际操作中可能遇到的各类疑难杂症的解决方案，力求做到详尽、客观、真实，以助您轻松驾驭各类RNA提取实验。

核心产品信息：

• 品牌（Brand）： QIAGEN（德国凯杰）

• 英文名（English Name）： RNeasy Mini Kit

• 中文名（Chinese Name）： RNeasy Mini 离心柱式总RNA提取试剂盒

• 货号（Catalog Number）： 74104

• 规格（Pack Size）： 50次制备（50 Preps）

• 主要应用（Application）： 适用于从动物细胞、人或动物组织、酵母等各类生物样本中快速分离纯化高质量的总RNA。

• 核心技术（Technology）： 基于硅胶膜选择性吸附的离心柱纯化技术（Spin Column Technology）。

• 下游应用兼容性： 纯化的RNA可直接用于RNA测序（RNA-Seq）、实时定量PCR（qRT-PCR）、终点法RT-PCR、Northern Blot、基因芯片（Microarray）分析以及体外翻译等各类敏感型下游实验。

二、 产品特点与优势

QIAGEN RNeasy Mini Kit 之所以能在众多RNA提取试剂中脱颖而出，得益于其精妙的设计和性能表现。其主要特点包括：

1. 极速高效的提取流程： 整个RNA纯化过程仅需约20至30分钟，极大地缩短了实验周期，相比传统的抽提法效率提升数倍。

2. RNA纯度与产量： 采用高盐结合、低盐洗脱的原理，配合精心优化的洗涤缓冲液，能够有效去除蛋白质、多糖、脂质以及其他大分子污染物。从不同量的起始材料中均能获得具有高A260/A280比值（通常在1.9至2.1之间）的纯净RNA。

3. 广泛的样本兼容性： 无论是疏松的哺乳动物细胞，还是致密的肝脏、脾脏组织，甚至是较难处理的酵母菌株，该试剂盒均能提供稳定可靠的提取结果。对于珍贵稀少的样本，甚至可兼容低至单个细胞的起始量。

4. 告别有毒有机溶剂： 传统的RNA提取方法（如TRIzol法）需要使用苯酚、氯仿等剧毒且易挥发的有机溶剂，不仅危害实验人员健康，还易造成环境污染。RNeasy Mini Kit 全摒弃了这些危险试剂，提供了一个安全、无毒的实验环境。

5. 灵活的通量选择： 除了手动离心操作外，该体系还可与QIAcube自动化工作站对接，实现1至12个样本的自动化纯化；同时，其底层化学原理也支持向96孔板高通量格式的平滑过渡。

6. 可整合柱上DNase消化： 对于痕量DNA残留极其敏感的下游应用（如单细胞测序或高灵敏度qPCR），该试剂盒可与RNase-Free DNase Set联用，在离心柱上直接进行DNase酶切反应，消除基因组DNA的干扰。

三、 工作原理详解

QIAGEN RNeasy Mini Kit 的核心技术在于其硅胶膜（Silica-Gel Membrane）纯化技术，这一技术的成功应用建立在严密的生物化学平衡之上。其具体工作机制可以分为以下四个关键阶段：

1. 强力裂解与RNase瞬间失活

试剂盒提供的裂解液Buffer RLT含有高浓度的异硫氰酸胍（Guanidine thiocyanate）和β-巯基乙醇（β-Mercaptoethanol）。异硫氰酸胍是一种强的蛋白质变性剂，能够迅速破坏细胞膜和核膜，使核酸释放到溶液中。与此同时，β-巯基乙醇作为一种还原剂，能够断裂RNase分子中的二硫键，导致RNase酶失活。这种双重保障机制确保了释放出的RNA不会在提取初期就被降解。

2. 盐诱导下的特异性吸附

在裂解并匀质化样本后，向裂解液中加入一定比例的乙醇（通常为70%或95%乙醇，视具体样本而定）。在高浓度盐离子（如盐酸胍）和醇类溶剂的共同作用下，RNA分子上的磷酸骨架与硅胶膜表面的硅醇基团发生强烈的脱水作用。这种脱水作用破坏了RNA在水相中的溶解度，促使RNA分子以其磷酸骨架通过氢键和静电引力特异性地吸附在硅胶膜上。而蛋白质、多糖、代谢物以及DNA等杂质则因为无法形成这种脱水结构，随滤液被去除。

3. 严格的阶段性洗涤

为了保证最终产物的纯度，吸附了RNA的硅胶膜需要经过两步严格的洗涤过程。第一步使用Buffer RW1，这是一种低浓度盐缓冲液，主要用于去除残存的蛋白质和其他水溶性杂质。第二步使用Buffer RPE，这是一种含有乙醇的洗涤缓冲液，其核心目的是去除痕量的盐分以及前面步骤中可能残留的有机溶剂。每一步洗涤后都需要进行高转速的空柱离心，以去除膜上残留的洗涤液，防止酒精等挥发性物质影响后续的洗脱效率和RNA的纯度指标。

4. 低盐环境下的高效洗脱

经过充分洗涤并短暂晾干的硅胶膜，其上的RNA处于一种紧密结合但可逆的状态。此时，加入无RNase的水（RNase-free water）或10 mM Tris-Cl (pH 7.5)。由于洗脱液的盐浓度极低，且水相环境恢复了RNA的溶解性，RNA分子迅速脱离硅胶膜表面，重新溶解于洗脱液中。通过适当的孵育时间和离心力，即可回收高浓度的纯净总RNA。

四、 解决实验中的哪些痛点与难题

在科研实验中，选择一款合适的提取试剂往往决定了实验的成败。QIAGEN RNeasy Mini Kit 针对性地解决了科研人员在传统RNA提取过程中面临的诸多棘手问题：

• 除了RNA降解的隐患： 传统酚氯仿抽提法操作繁琐、耗时较长，样本在操作中暴露于常温环境过久极易导致RNA被内源性或外源性RNase降解。本试剂盒通过“秒级"裂解锁存机制和全程低温/快速操作指导，将RNA降解的风险降至很低。

• 有效规避了有机溶剂的毒性危害： 酚和氯仿不仅具有强烈的腐蚀性，其挥发气体还会对实验人员的呼吸道和皮肤造成严重伤害。本试剂盒全程无需接触此类危险品，提升了实验室的安全系数。

• 攻克了微量样本提取效率低下的难关： 在激光捕获显微切割（LCM）或流式细胞术（FACS）分选实验中，研究人员往往只能获得极少量的细胞。传统沉淀法在处理微量样本时损耗极大，而得率极低。本试剂盒的微型离心柱和特异性结合条件，能够高效捕获低至皮克（pg）级别的RNA，哪怕是单个人类细胞也能顺利提取出可用于qPCR的RNA量。

• 消除了痕量DNA污染的干扰： 在基因表达定量分析中，微量的基因组DNA污染会导致Ct值提前，造成假阳性或定量偏高。本试剂盒不仅通过优化的盐浓度抑制了DNA的结合，还提供了成熟的 On-column DNase 消化方案，确保获得的RNA绝对纯净。

• 摆脱了昂贵精密仪器的束缚： 不同于需要昂贵磁棒法自动提取仪或笨重的真空 manifolds，本试剂盒仅需一台常规台式离心机即可完成全部操作，极大地降低了设备门槛和运行维护成本。

五、 储存条件与试剂准备

为了保证试剂盒各组分的稳定性和最佳性能，正确的储存至关重要。

1. 储存条件：

• 未开封试剂盒： 应于室温（15-25℃）干燥避光保存。在此条件下，所有组分在包装标示的有效期内均保持稳定。

• 开封后储存：

 • RNeasy Mini离心柱（Spin Columns）： 含有硅胶膜，极易受潮。使用后应立即盖紧管盖，室温保存。

 • Buffer RLT（裂解液）： 含有异硫氰酸胍，室温保存。若出现结晶，可于37℃水浴助溶。

 • Buffer RW1 与 Buffer RPE（洗涤液）： 室温保存。

 • RNase-free water（洗脱液）： 室温保存。

• 工作液配制及稳定性：

 • Buffer RPE 浓缩液： 使用前必须按瓶身标签指示加入指定体积的无水乙醇（Ethanol）。配制后的Buffer RPE可在室温下稳定保存至少1年。

 • Buffer RW1 浓缩液： 某些批次的Buffer RW1在出厂时为浓缩状态，需按标签指示稀释后使用。稀释后室温保存。

 • β-巯基乙醇（β-ME）添加： 使用前必须向Buffer RLT中加入β-巯基乙醇（终浓度为1%）。注意：含β-ME的Buffer RLT在室温下可稳定保存1个月；若分装后置于-20℃，则可保存更久。

2. 耗材准备：

实验过程中务必使用无RNase的离心管和吸头。所有涉及RNA操作的台面、移液器及实验服均需保持清洁，建议配备专用的RNA操作移液器。

六、 详尽使用方法与实验操作指南

以下为使用 QIAGEN RNeasy Mini Kit (货号 74104) 进行常规细胞或组织总RNA提取的标准操作流程。整个流程需在15-25℃环境下进行。

第一阶段：实验前的准备工作

1. 配制Buffer RLT工作液： 取出Buffer RLT，根据单次实验所需用量，按1%的体积比加入β-巯基乙醇（例如：1 mL Buffer RLT加入10 μL β-ME）。混匀后室温放置。

2. 稀释洗涤液： 确认Buffer RW1（如需稀释）和Buffer RPE已按说明书要求加入适量无水乙醇。使用前在瓶身做好标记。

3. 准备无RNase水： 将RNase-free water预热至55-60℃，这有助于提高RNA的洗脱效率。

4. 样本预处理：

  • 贴壁细胞： 吸除培养液，直接用PBS洗涤一次。然后直接向培养皿中加入适量Buffer RLT，反复吹打使细胞全裂解。

  • 悬浮细胞： 收集细胞至离心管，弃上清，加入Buffer RLT重悬沉淀。

  • 组织样本： 称取10-30 mg新鲜或RNAprotect保存的组织，放入含有Buffer RLT的离心管中，使用TissueRuptor II等匀浆器匀质化至无肉眼可见颗粒。

第二阶段：RNA的结合与洗涤

5. 调节结合条件： 向匀浆液或裂解液中加入等体积的70%乙醇（例如：600 μL裂解液加600 μL 70%乙醇），立即上下颠倒混匀。此时可能会形成半透明沉淀，属正常现象。

6. 上柱吸附： 将RNeasy Mini离心柱放入2 mL收集管中。将样本-乙醇混合液（约650 μL）转移至离心柱内，盖上管盖，10,000 × g 离心15秒。将流出液弃去。

7. 重复上样： 将剩余混合液加入离心柱，再次10,000 × g 离心15秒，弃废液。

8. 第一次洗涤（Buffer RW1）： 向离心柱中加入350 μL Buffer RW1，盖上管盖，10,000 × g 离心15秒，弃废液。

9. 第二次洗涤（Buffer RPE）： 向离心柱中加入500 μL Buffer RPE，盖上管盖，10,000 × g 离心15秒，弃废液。

10. 空柱干燥： 将离心柱重新放回收集管，最大转速（≥13,000 × g）离心2分钟。此步骤至关重要，能去除膜上残留的乙醇，防止其影响下游酶促反应。

第三阶段：RNA的洗脱

11. 转移离心柱： 将RNeasy Mini离心柱移至一个新的1.5 mL无RNase离心管中。

12. 加入洗脱液： 向硅胶膜中央加入30-50 μL预热的无RNase水。室温静置1-5分钟，让RNA充分溶解。

13. 离心收集： 10,000 × g 离心1分钟，管底即为纯化好的总RNA。

14. 浓度测定与保存： 取1-2 μL洗脱的RNA使用分光光度计（如Nanodrop）测定浓度和纯度。剩余RNA可分装后保存于-70℃至-80℃，避免反复冻融。

(注：若需进行柱上DNase消化，需在第一步洗涤Buffer RW1之后，加入配制好的DNase I反应液，室温孵育15分钟，然后再继续进行Buffer RPE洗涤步骤。)

七、 常见问题与深度解决方案（FAQ）

在实际操作过程中，即便遵循标准流程，实验人员也可能遇到各种突发状况。以下是针对本产品的常见疑难问题及其背后的原因剖析与解决对策：

1. 提取出的RNA中含有基因组DNA（gDNA）污染，导致qPCR出现非特异性扩增或熔解曲线异常。

原因分析：

• 起始样本量过大，超出了硅胶膜的吸附容量，导致部分DNA非特异性结合。

• 加入乙醇后未充分混匀，导致局部盐分过高，引起DNA共同沉淀。

• 样本本身富含DNA（如脾脏、胸腺等），常规洗涤难以全去除。

解决方案：

• 优化样本量： 严格控制在推荐范围内（如细胞不超过1×10^7，组织不超过30 mg）。

• 强化混匀步骤： 在加入70%乙醇后，务必立即剧烈上下颠倒混合，确保溶液均一。

• 启用DNase消化： 强烈建议增加On-column DNase I处理步骤。具体操作是在Buffer RW1洗涤后，向柱子中加入50 μL DNase I 工作液（含5 μL DNase I 原液和45 μL Buffer RDD），室温静置15分钟，然后再用Buffer RW1清洗一次以终止反应。

2. RNA得率极低，远低于预期值。

原因分析：

• 样本未能充分裂解或匀质化，导致RNA未被全释放。

• 洗脱步骤操作不当，RNA未全从膜上洗脱下来。

• 样本保存不当，RNA在提取前已经发生严重降解，导致小分子片段在洗涤步骤中被洗掉。

解决方案：

• 加强匀浆力度： 对于纤维丰富的组织（如心脏、骨骼肌），需延长匀浆时间或使用更锋利的研磨头；对于细胞团块，需先将其打散。

• 优化洗脱条件： 使用预热至55℃的无RNase水进行洗脱，并在加入水后室温孵育2-5分钟，以增加RNA的溶解度。若洗脱得率不高，可将洗脱液再次上柱，进行二次洗脱。

• 规范样本保存： 新鲜样本应尽快提取；若无法立即提取，应迅速冷冻于液氮中，或浸泡于RNAprotect Tissue Reagent中室温保存。

3. RNA发生明显降解，琼脂糖凝胶电泳中28S和18S核糖体RNA条带模糊或呈弥散状。

原因分析：

• 实验环境中存在外源性RNase污染（如移液器、枪头、离心管或实验台面）。

• 裂解液Buffer RLT中未添加β-巯基乙醇，或添加后存放过久失效。

• 样本解冻过程缓慢，在未全融化前RNase即开始复苏并降解RNA。

解决方案：

• 建立无RNase环境： 实验前用RNase清除剂擦拭台面和移液器。更换新的无RNase枪头和离心管。操作时始终佩戴一次性手套。

• 检查裂解液状态： 确保Buffer RLT中已按比例添加β-巯基乙醇，且现配现用（室温下一个月内使用完毕）。

• 快速解冻样本： 将冻存样本从-80℃取出后，立即投入液氮预冷，或在冰上迅速操作，缩短其在RNase活跃温度（如37℃）下的暴露时间。

4. A260/A280 比值偏低（小于1.8），提示存在蛋白质或其他有机溶剂污染。

原因分析：

• Buffer RPE中含有乙醇，若最后一次离心后未将离心柱管壁晾干，残留的乙醇会混入洗脱液中，吸收230 nm和280 nm处的紫外线。

• 洗涤步骤中Buffer RW1或Buffer RPE的用量不足，未能洗净硅胶膜上的杂质。

解决方案：

• 增加空柱离心时间： 在最后一次洗涤（Buffer RPE）并离心后，务必将离心柱重新插入收集管，以最大转速（≥13,000 × g）额外离心2分钟。确保管盖和管底边缘无任何液体残留。

• 确保洗涤液覆盖全膜： 加入洗涤液时，应尽量将液体加在硅胶膜的中央，并观察液面是否全覆盖了膜的表面。可适当增加洗涤液的体积（如RW1加至400 μL，RPE加至600 μL）。

5. A260/A230 比值异常（通常低于2.0甚至更低）。

原因分析：

• 这是RNA提取中最常见的纯度问题之一。A260/A230偏低意味着样本中存在盐离子（如盐酸胍）、EDTA或多糖等污染物的残留。

• 通常是因为最后一次洗涤步骤不够充分，导致硅胶膜上残留了高浓度的盐离子。

解决方案：

• 增加RPE洗涤次数： 在标准的操作流程中增加一次Buffer RPE的洗涤（即总共洗涤两次），每次洗涤后均需充分空柱离心去乙醇。

• 检查乙醇添加量： 确认在配制Buffer RPE时加入了足量的无水乙醇。如果乙醇浓度过低，将无法有效去除盐分。

6. 洗脱体积小，但测得的RNA浓度依然很低。

原因分析：

• 洗脱液未全覆盖硅胶膜，导致部分RNA仍干结在膜上。

• 使用的洗脱液体积过小（如低于30 μL），不足以将膜上的RNA全溶解带下。

解决方案：

• 控制洗脱体积： 建议洗脱体积设定在30-50 μL之间。体积过小易导致粘度过大，RNA难以全溶解；体积过大则会稀释RNA浓度。

• 延长孵育时间： 加入洗脱液后，不要立即离心，而是在室温下静置3-5分钟，让水充分渗透硅胶膜，溶解RNA。

• 分步洗脱法： 若样本极其珍贵且初始体积大，可采用两次洗脱法。第一次加入30 μL水，离心收集；第二次再加入30 μL水，再次离心收集于同一管内。

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更多产品信息，请联系中国区域代理商：上海起发实验试剂有限公司

（注：本文内容基于品牌公开资料及行业常规信息整理，具体以品牌信息文档为准。）

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