QIAGEN EndoFree Plasmid Kit 无内毒素质粒大提试剂盒（货号12362）说明书

🧬 产品描述（Product Description）

• 英文全名：EndoFree Plasmid Kit

• 中文译名：无内毒素质粒纯化试剂盒

• 国际通用货号 (Catalog No.)：12362

• 品牌：QIAGEN（德国凯杰生物）

• 核心规格：Maxi规格（单次实验可处理至多10 mg高拷贝质粒DNA或柯斯质粒DNA）

• 试剂盒核心组分：预装填QIAGEN-tip 500重力柱、专属QIAfilter Maxi过滤柱、无内毒素级专用缓冲液体系（包含近期配方升级后的Buffer ER等）、以及保障高产的LyseBlue指示试剂。

本产品是QIAGEN公司基于数十年的核酸纯化经验，专为需要极低内毒素环境的高级分子生物学应用而量身定制的解决方案。它将高效的内毒素去除步骤整合到经典的质粒纯化流程中，无需额外增加亲和层析步骤，也无需使用繁琐的CsCl（氯化铯）超速离心法，即可在短短数小时内，从大规模的大肠杆菌培养物中，一步到位地提取出纯度超越两次CsCl梯度离心法的超纯质粒DNA。

✨ 产品核心特点（Key Features）

1. 极低的内毒素控制标准

   经过严格的去内毒素工艺处理，最终纯化得到的质粒DNA内毒素水平稳定低于0.1 EU/µg。这为对内毒素极为敏感的原代细胞、悬浮细胞及干细胞转染提供了坚实的保障。

2. 极速且集成的去内毒素流程

   告别过去需要额外购买去内毒素柱子或进行复杂的亲和层析步骤。本试剂盒将内毒素的清除无缝嵌入到常规的质粒提取流程中，不增加额外操作步骤，大幅节约宝贵的实验时间。

3. 产量与纯度表现

   无论是高拷贝质粒还是低拷贝质粒（柯斯质粒），该系统都能提供令人满意的得率。搭配LyseBlue显色试剂，能够直观监控菌体裂解程度，确保每一次都能获得最佳的裂解效果和量大化的DNA产量。

4. 广泛的敏感实验适用性

   提取的DNA不仅适用于常规的酶切、PCR、测序等，更是基因治疗研究、基因沉默（RNAi）、显微注射以及各类敏感真核细胞转染的黄金标准。

📦 储存条件（Storage Conditions）

为了保证各组分的最佳活性和稳定性，请将试剂盒存放于阴凉干燥处，温度控制在 15–25°C（室温） 下避光保存。

注意：部分含有酶制剂或特定蛋白的缓冲液（如添加了RNase A的Buffer P1）在收到后需参照具体附录说明，按需存放于2–8°C冰箱。每次使用后请及时拧紧瓶盖，避免缓冲液挥发或受到微生物污染。

⚙️ 工作原理（Working Principle）

EndoFree Plasmid Kit 的核心提纯机制建立在 QIAGEN 的阴离子交换层析技术（Anion-Exchange Technology） 与现代过滤技术相结合的坚实基础之上。整个过程巧妙利用了不同分子在特定高盐缓冲液中带电性质的差异，实现了对质粒DNA的净化。

第一步：高效裂解与智能过滤

实验起始于细菌的碱裂解法。随后，传统的低速离心去沉淀步骤被创新的 QIAfilter 过滤柱 所取代。该过滤装置能在几分钟内快速、干净地清除裂解液中的SDS沉淀、细胞碎片及高分子量基因组DNA，相比传统离心法可节省高达1小时的等待时间。

第二步：专有的内毒素清除（核心机密）

在大肠杆菌等革兰氏阴性菌的细胞壁中，含有大量的脂多糖（LPS，即内毒素）。在裂解过程中，这些内毒素会被释放到上清液中。此时，试剂盒的 Buffer ER（内毒素清除缓冲液） 登场。该缓冲液能特异性地与内毒素结合形成复合物，在随后的重力流层析过程中，这些复合物会被有效截留或随杂物流穿，从而极大地降低了最终产物的内毒素水平。

第三步：阴离子交换层析纯化

处理后的澄清裂解液被加载到预装填有独特阴离子交换树脂的 QIAGEN-tip 上。在特定的低盐和中性的pH条件下，带负电荷的质粒DNA分子会与树脂上的正电荷基团发生强烈的静电吸附。而RNA、蛋白质、代谢副产物以及其他小分子杂质则因带电性质不同而随流穿液被轻松去除。随后，使用中等盐浓度的缓冲液进行进一步洗涤，最后用高盐缓冲液将纯净的超螺旋质粒DNA洗脱下来。

第四步：沉淀与复溶

洗脱下来的DNA经过异丙醇沉淀，去除残留的盐分，离心收集后，用无内毒素的TE或水溶解，即可得到可用于下游应用的超纯质粒。

🛡️ 解决的实验痛点（Problems Solved）

在生命科学研究中，普通质粒提取试剂盒往往难以满足需求，主要体现在以下几个痛点，而本产品正是为了解决这些问题而生：

1. 攻克低转染效率难题

   内毒素会与转染试剂（如脂质体、磷酸钙等）发生非特异性结合，抢占“结合位点"，从而阻碍质粒DNA进入细胞。使用本试剂盒清除了这一障碍，显著提升了难转染细胞（如原代细胞、免疫细胞）的转染成功率。

2. 消除细胞毒性带来的数据偏差

   在细胞功能实验或药物筛选中，微量的内毒素就足以激活巨噬细胞、B细胞等免疫细胞的Toll样受体（TLR4），诱导白细胞介素-1（IL-1）、前列腺素等炎症因子的释放。这会导致严重的实验背景噪音，使研究者误判基因功能。本产品能提供“洁净"的DNA模板，确保实验结果的真实性和可重复性。

3. 满足基因治疗与体内实验的严苛要求

   如果将质粒DNA直接用于动物体内（如小鼠尾静脉注射）或基因治疗载体包装，内毒素的存在会引发致命的“内毒素休克综合征"并激活补体级联反应。本试剂盒的内毒素清除能力符合体内实验的安全门槛。

4. 替代繁琐且危险的CsCl超速离心法

   过去为了获得无内毒素的高纯质粒，科研人员不得不采用两次连续的氯化铯超速离心，这不仅耗时数天，还需接触剧毒的溴化乙锭（EB）和苯酚/氯仿。本试剂盒在提供同等甚至更高纯度的同时，将操作时间压缩至几个小时，且全程无毒无害。

🧪 标准使用方法（Experimental Procedure）

为了确保您能获得最佳的提取效果，请严格按照以下核心步骤进行操作（具体操作细节请以随盒附带的纸质/电子版手册为准）：

1. 菌体收集与重悬

   取适量过夜培养的细菌液，离心收集菌体沉淀。加入 Buffer P1（已添加RNase A和LyseBlue试剂），充分涡旋或移液器吹打，直至菌体分散，溶液呈现均匀的蓝色。（LyseBlue能直观提示重悬是否充分，若存在未裂解的白色团块，说明重悬不够，需继续吹打。）

2. 碱裂解

   加入 Buffer P2，立即轻轻颠倒混匀4-6次，直至溶液变得澄清透亮（呈棕色或深蓝色）。此步骤不可超过5分钟，且动作必须轻柔，以免基因组DNA断裂污染。

3. 中和与除杂

   加入 Buffer P3，立即轻柔颠倒混匀4-6次。此时会有大量白色絮状沉淀生成。将此混合液转移至 QIAfilter Maxi 过滤柱 中，静置2-5分钟，然后拔开塞子，让液体靠重力流下，收集澄清滤液。

4. 内毒素清除处理

   向滤液中加入准确体积的 Buffer ER，充分混匀后，置于冰上孵育15-30分钟。此步骤是去除内毒素的核心环节。

5. 平衡与上样

   在孵育的同时，用 Buffer QBT 平衡 QIAGEN-tip 500 重力柱。将孵育好的裂解液加载到柱子上，让其缓慢流过树脂床。

6. 洗涤与洗脱

   用 Buffer QC 清洗柱子数次，去除残留的RNA和蛋白杂质。最后，用预热至50-60°C的 Buffer QN 将纯净的质粒DNA洗脱到一个干净的离心管中。

7. 沉淀与溶解

   加入异丙醇混匀，在4°C或室温下高速离心。弃去上清，用70%乙醇洗涤DNA沉淀，短暂离心弃去乙醇，晾干后，用无内毒素的 Buffer TE 或水溶解DNA。

❓ 常见问题与解决方案（FAQ & Troubleshooting）

在实际操作过程中，您可能会遇到一些技术疑问。以下是针对本产品的常见困惑及解答：

Q1：为什么我在添加 LyseBlue 试剂后，Buffer P1 中会出现沉淀？

A1： 这是一种正常的物理现象。LyseBlue 试剂中的某些成分在低温下溶解度较低，加入 Buffer P1 后产生轻微沉淀属于正常范围。这些沉淀在后续加入 Buffer P2（裂解液）时会溶解。建议每次使用前务必剧烈涡旋振荡 Buffer P1，使 LyseBlue 颗粒充分重悬均匀。

Q2：如何有效防止 QIAfilter 过滤柱在发生堵塞？

A2： 过滤柱堵塞通常是由于菌体裂解不充分或中和不全导致的。请确保菌体在 Buffer P1 中打散，无粘性团块；加入 Buffer P2 后需立即轻柔颠倒混匀；加入 Buffer P3 后，白色沉淀应漂浮在上层，若贴在管壁，请用无菌吸头将其轻轻推至液面中央，以防其堵塞下方滤网。

Q3：我的质粒得率偏低，可能的原因有哪些？

A3： 得率低通常归因于以下几个方面：① 细菌培养条件不佳，建议优化培养基和摇菌时间；② 菌体沉淀未重悬，导致裂解不充分；③ 上样量超过了 QIAGEN-tip 的最大结合容量。请严格按照说明书推荐的培养体积进行实验。④ 最后一步洗脱时，确保 Buffer QN 的温度在50-60°C之间，低温会导致DNA结合过紧难以洗脱。

Q4：提取的质粒中存在基因组DNA（gDNA）污染怎么办？

A4： 基因组污染往往是因为在加 Buffer P2 和 Buffer P3 后混匀动作过于剧烈，导致了高分子量基因组DNA的剪切泄漏。请务必轻柔操作，仅做4-6次缓慢的颠倒混匀。此外，确保菌体重悬也能有效避免粘稠的基因组DNA混入上清。

Q5：该试剂盒提取的质粒可以直接用于体外转录（IVT）吗？

A5： 可以。按照标准流程提取的质粒纯度高，不含可检测的蛋白质、RNA或其他抑制剂。尽管流程中使用了RNase A，但其在后续的QC洗涤步骤中已被清除，不会对下游的体外转录实验产生任何负面影响。

Q6：如果我手头已经有普通试剂盒提取的质粒，还能再用这个试剂盒去内毒素吗？

A6： 可以的。您可以购买单独的 EndoFree Plasmid Buffer Set（无内毒素缓冲液套装），按照其补充方案，对已经纯化好的质粒DNA进行二次处理，同样能有效去除其中混杂的内毒素。

Q7：Buffer ER 的成分是什么？可以单独购买吗？

A7： Buffer ER 是 QIAGEN 去除内毒素的核心机密配方，其具体成分未公开，且该缓冲液不作为独立单品出售，仅包含在各规格的 EndoFree Plasmid Kit 或无内毒素缓冲液套装中。

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更多产品信息，请联系中国区域代理商：上海起发实验试剂有限公司

（注：本文内容基于品牌公开资料及行业常规信息整理，具体以品牌信息文档为准。）

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