Lumafluor Red Retrobeads™ IX (R180-100) 红色逆向示踪荧光微粒 说明书

 一、产品描述

货号： R180（亦作R180-100 / 78R180）

英文名称： Red Retrobeads™ IX (100 µl)

中文名称： Lumafluor 红色逆向示踪荧光微粒 IX（100微升）

品牌： Lumafluor

产地： 美国

规格： 100 µl/支（浓缩液，蒸馏水中悬浮）

核心成分： 罗丹明（Rhodamine）标记的荧光聚合物微球，粒径范围约50–200 nm（混合粒径分布），微球浓度约为1×10⁹ beads/ml

激发/发射波长： 最大激发波长约530 nm，最大发射波长约590 nm

荧光颜色： 红色

包装形式： 密封小瓶，内含浓缩微球悬浮液

特约代理经销商（中国区）：上海起发实验试剂有限公司

应用领域： 神经科学、细胞生物学、发育生物学、药物递送研究、活体示踪研究、免疫组织化学、原位杂交

适用物种： 小鼠、大鼠、斑马鱼、非人灵长类等哺乳动物及冷血动物

供货周期： 现货

保质期： 正确储存条件下可保持数年稳定；建议一年内使用完毕以获得最佳效果

 二、产品特点

1. 经文献充分验证的有效性

Retrobeads™ 是Lumafluor公司原创开发的逆向示踪荧光微球产品，其有效性已被数百篇同行评议研究论文所证实，覆盖从无脊椎动物到灵长类动物的多种实验系统。相关研究成果发表于《Nature》《Science》《Neuron》《Nature Communications》《Cell Reports》等学术期刊。目前绿色和红色荧光Retrobeads™仅由Lumafluor供应。

2. 强烈的荧光信号

R180采用罗丹明荧光染料封装技术，微球发出明亮且稳定的红色荧光。在复杂的生物组织环境中，神经元示踪信号清晰可见，实验观察的灵敏度和准确性较好。即使在较长时间的光学观察或显微摄影过程中，微球荧光信号也不易出现明显衰减。

3. 精准的逆行示踪能力

该微球通过物理注射导入目标神经区域后，可被神经末梢摄取并沿轴突逆向运输至神经元胞体，从而实现对神经元投射路径的精准标记。注射后微球在注射位点扩散范围通常小于1 mm，适合精细神经环路的连接组学研究。

4. 良好的生物相容性

R180红色逆行示踪微球对活细胞或活体无毒，在实验过程中不会对神经元的正常生理活动产生明显干扰，也未观察到引起细胞损伤或死亡的明确证据。微球已通过FDA Class VI生物材料认证，支持清醒动物在体实验。

5. 长期稳定性

在正确储存和使用条件下，R180的荧光信号在体内可维持14个月以上无明显质量下降，细胞内标记可长期留存。这一特性使其适合需要长期追踪的神经科学研究项目。

6. Retrobeads™ IX系列的增强功能

R180属于IX（Improved eXperience）改进型产品，相比经典款R170具有以下升级特性：微球表面经特殊处理，促进蛋白质及其他生物活性化合物的吸附；可将神经营养因子、神经递质激动剂/拮抗剂等多种生物活性物质递送至局部区域，通过逆行转运确定哪些神经元暴露于这些化合物；在灵长类动物系统中的示踪效率优于标准Retrobeads™。

7. 广泛的兼容性

R180与大多数其他顺行示踪剂（如BDA）、病毒载体、纳米颗粒、原位杂交检测技术及免疫组织化学技术兼容。可与GFP/YFP等荧光蛋白联合使用而无光谱重叠干扰。

8. 多尺度、多物种适用性

已成功应用于小鼠、大鼠、斑马鱼胚胎及非人灵长类动物。支持从单细胞层面（30–50 µm玻璃电极微量注射）到全脑网络层面（多点注射）的多种研究需求，适配立体定位注射仪。

 三、储存条件

储存温度： 4°C冰箱冷藏保存

环境要求： 存放于加湿容器中，防止溶液蒸发

避光要求： 建议避光保存

严禁冷冻： 冷冻会导致微球失效，且无法挽回。被冻结的微球将全丧失示踪功能。

严禁干燥： 若微球溶液变干，无法重新悬浮恢复，视为报废。

有效期： 在正确储存（4°C避光冷藏、密封防蒸发、不冷冻）的条件下，产品可保持稳定数年。尽管未设定明确的货架寿命上限，但建议在收到产品后一年内使用完毕，以获得最佳实验效果。

反复冻融： 必须避免。每次取用后应立即放回冰箱冷藏。

 四、工作原理

1. 逆行示踪的基本原理

R180的工作原理基于神经元轴突运输机制。当微球悬浮液被注射到目标脑区或神经组织后，局部神经末梢通过内吞作用摄取这些荧光微球。微球随后被装入逆向运输囊泡，沿轴突以逆向（从末梢向胞体）方向运输，最终富集于神经元的胞体内。科研人员在后续切片观察时，即可在荧光显微镜下直接识别被标记神经元的胞体位置，从而绘制出该脑区接收输入的神经元来源图谱。

2. 荧光标记的持久性

与传统示踪剂（如辣根过氧化物酶HRP，标记通常仅维持数周）不同，荧光微球的信号不依赖细胞的代谢活性来维持。罗丹明染料被封装在聚合物微球基质内部，受到物理保护，不易被光漂白或酶降解。这使得标记信号可以在活细胞中无限期存续（超过1年），且不随细胞分裂或时间推移而显著衰减。

3. IX改进型的生物活性物质递送功能

Retrobeads™ IX系列在微球表面进行了化学修饰，使其更易吸附蛋白质和其他生物活性分子。研究人员可将微球预先与神经营养因子（如NGF、BDNF）或神经递质受体激动剂/拮抗剂孵育，使这些物质吸附于微球表面。注射后，微球在逆行运输过程中将所携带的生物活性物质递送至神经元胞体，实现局部、靶向的功能干预。通过检测哪些神经元被标记，即可确定哪些细胞群接受了活性物质的作用。

4. 荧光激发与检测

R180中的红色荧光染料为罗丹明，最大激发波长约530 nm，最大发射波长约590 nm。在荧光显微镜下使用标准罗丹明滤光片组即可检测。蔡司（Zeiss）和徕卡（Leitz/Leica）的标准罗丹明滤光片组均可获得良好的观察效果。与共聚焦显微镜、双光子显微镜、光片显微镜等多种成像设备兼容。

 五、解决实验中的哪些问题

1. 传统示踪剂标记时间短

HRP（辣根过氧化物酶）等传统示踪剂的标记信号通常仅能维持数周，无法满足长期追踪实验的需求。R180在体内可稳定标记超过1年，适合慢性实验、发育研究及长期神经可塑性观察。

2. 示踪剂扩散范围难以控制

许多化学示踪剂在注射后会沿组织间隙扩散，导致标记区域不精确。R180注射后扩散范围通常小于1 mm，注射位点高度局限，适合精细的局部 connectivity 研究和小型核团标记。

3. 标记信号的光漂白问题

常规荧光染料在长时间光照下容易光漂白，影响成像质量。R180的微球结构将染料封装保护，即使经过长时间观察或多次拍摄，荧光信号也不易出现明显衰减。

4. 多色标记与多技术联用需求

在需要同时标记多条神经通路或结合其他检测技术的实验中，R180提供红色荧光通道，可与绿色荧光微球（G180）、病毒示踪剂、免疫组化、原位杂交等技术联合使用，互不干扰。

5. 活体/清醒动物实验的安全性

部分示踪剂对活体具有毒性或需要通过病毒载体实现标记。R180对活细胞和活体无毒，已通过生物安全性认证，适用于清醒动物在体实验，也支持尾静脉注射等全身性给药方式。

6. 灵长类动物中的示踪效率

标准逆行示踪剂在灵长类动物大脑中的标记效率往往不理想。R180作为IX改进型产品，在灵长类系统中的示踪效果优于标准Retrobeads™，已成功应用于灵长类动物视觉皮层投射图谱绘制等研究。

 六、使用方法

第一步：实验准备

从4°C冰箱中取出R180微球溶液，检查溶液状态。正常产品应为均匀的红色悬浮液。如发现有沉淀，可轻轻涡旋或吹打混匀，避免剧烈振荡产生气泡。根据实验设计确定注射方案。

第二步：稀释（如需要）

R180红色微球可原液使用，也可进行稀释。在大鼠视觉皮层实验中，1:4稀释度（如用无菌PBS或蒸馏水按1份微球加3份稀释液）经验证不会降低逆行标记的质量或范围。除蒸馏水外，标准盐溶液（NaCl、KCl）也可作为稀释剂。对于初次实验，强烈建议使用原液全强度注射，以确保获得可靠的标记效果。绿色微球（G180）不建议稀释，需原液使用。

第三步：动物麻醉与固定

以啮齿类动物为例，使用异氟烷等吸入麻醉剂麻醉动物，将其头部固定于立体定位仪（stereotaxic frame）上。维持麻醉深度约1.5%–2.5%异氟烷。手术暴露颅骨后，根据脑图谱确定目标坐标，进行开颅。

第四步：微量注射

R180适合使用压力注射系统进行注射。常用配置包括1 mL汉密尔顿（Hamilton）微量注射器或气动注射系统（如Picospritzer）。对于小范围局部环路研究，可使用直径30–50 µm的玻璃微量移液管，注射体积约30–50 nL。对于常规逆行示踪，可使用较大口径的注射针头，注射体积约0.1–0.3 µL。注射速度建议控制在70–100 nL/min左右。注射完成后，留针等待数分钟再缓慢撤针，以减少回流。

由于微球注射后扩散范围有限（<1 mm），如需标记投射至较大核团的全部神经元，需要在目标区域内进行多点注射。不推荐使用离子透入法（iontophoresis）进行微球示踪。

第五步：术后恢复与存活期

温血脊椎动物的最短有效存活期为注射后约24小时。标记强度在48小时内随时间递增，48小时后趋于稳定。大多数实验选择术后存活7–14天再进行灌注取材。最长可检测期尚未确定，但注射后14个月的标记质量和范围未见明显变化。冷血动物建议初始存活期设为1周。

第六步：灌注固定

以0.1 M磷酸缓冲液（PBS，pH 7.4）经心脏灌注冲洗血液，随后用4%多聚甲醛（PFA，溶于0.1 M磷酸缓冲液，pH 7.4）灌注固定。固定时间视组织大小而定，通常为1–3天（4°C后固定）。

注意：避免使用戊二醛（glutaraldehyde）。 戊二醛会引起明显的组织自发荧光，可能遮蔽微球标记信号。绿色微球在戊二醛固定的样本中尤其不可见。

第七步：切片制备

将固定好的脑组织取出，可在OCT包埋后于冰冻切片机（cryostat）上切制冠状面或其他所需方位的切片。常用切片厚度为16–60 µm，推荐30–40 µm。切片收集于磷酸缓冲液中，贴附于明胶包被的载玻片上，室温空气干燥。

第八步：封片与观察

切片充分干燥后，可用二甲苯透明约1分钟，随后使用Fluoromount™或Krystalon等封片剂封片。封片时建议使用抗淬灭封片剂，以更好地保护荧光信号。

注意： 微球对甘油敏感，含甘油的封片剂会导致荧光快速淬灭，应避免使用。水杨酸甲酯（methyl salicylate）可作为甘油的替代选择。酒精和二甲苯短时间接触（<5分钟）对微球无害，但长时间暴露（超过5分钟）会破坏微球。

封片后的载玻片如保存在暗处，细胞内的标记信号至少1年内不会明显褪色（尽管组织自发荧光背景可能随时间增加）。

 七、显微镜观察建议

滤光片选择： R180使用罗丹明滤光片组检测。蔡司和徕卡的标准罗丹明滤光片均可获得良好效果。部分老款尼康罗丹明滤光片组背景较高，可能影响标记细胞的识别，建议避开。

物镜选择： 低倍率、低数值孔径的干镜（如4×、10×）通常难以观察到标记信号。建议使用数值孔径0.4以上的10×浸液物镜或更高倍率的干镜。25×浸液物镜往往能清晰呈现低倍镜下遗漏的标记细胞。在判定实验是否成功前，务必在注射位点附近使用浸液物镜仔细检查切片。

绿色微球补充说明： 绿色微球的激发波长较短（最大激发约460 nm），组织自发荧光干扰更为显著。建议使用宽波段荧光素滤光片（narrow-band FITC滤片信号较弱）。为降低背景，可采取以下措施：使用更薄的切片（如30 µm而非40–50 µm）；选用幼年动物（P14之前），其组织自发荧光更低且运输效率更好；封片后尽快观察（背景会随时间增加）。

 八、常见问题与解决方案

问题一：注射后未观察到标记信号

可能原因及对策：注射体积过小或注射位点偏离目标区域。建议实验使用原液全强度注射，注射量不低于0.1 µL。使用更大直径的玻璃电极或多点注射覆盖目标区域。此外，务必使用浸液物镜在注射位点附近仔细检查，低倍干镜容易遗漏信号。存活时间不足24小时也可能导致标记不充分，建议至少等待48小时再取材。

问题二：标记信号弱

可能原因及对策：微球可能未充分混匀，使用前请轻轻涡旋。如使用了稀释液，建议改回原液注射进行对比。注射速度过快可能导致微球在针尖聚集堵塞，建议控制在70–100 nL/min。检查滤光片组是否匹配——罗丹明滤光片为必需。

问题三：背景荧光过高，标记信号被掩盖

可能原因及对策：固定过程中使用了戊二醛，应改用4%多聚甲醛。切片厚度过大也会加剧背景，建议控制在30–40 µm。如使用绿色微球，建议选用幼年动物并尽快观察。载玻片放置时间过久会导致背景自发荧光增加，建议封片后尽早成像。

问题四：微球扩散范围超出预期

R180本身的扩散范围通常小于1 mm，如观察到更大范围的扩散，可能与注射体积过大或注射速度过快有关。建议降低注射量至30–50 nL/点，并使用更细的玻璃电极（30–50 µm）进行精确注射。

问题五：能否与其他示踪剂或病毒联用

可以。R180已验证可与病毒载体（如AAV、慢病毒）、传统顺行示踪剂（如BDA、CTB）、纳米颗粒等联合使用。在多重标记实验中，R180的红色通道（530/590 nm）与GFP/YFP等绿色荧光蛋白无光谱重叠，可实现双色或多色标记。

问题六：微球是否可以用于体外实验

可以。R180适用于体外实验，包括细胞培养、膜片钳记录、流式细胞分选等。微球可用于标记培养中的神经元，也可用于细胞爬片的示踪研究。

问题七：IX版本与经典版（R170）有何区别，如何选择

R180（Red Retrobeads™ IX）在R170经典款的基础上增加了生物活性物质吸附功能，表面化学修饰使其能更有效地携带蛋白质、神经营养因子及神经递质相关化合物。IX版本在灵长类动物系统中的示踪效率更高。如实验仅涉及常规逆行示踪，R170已能满足需求；如需递送生物活性物质或在灵长类中做示踪，建议选择R180。

问题八：产品储存超过1年还能用吗

在正确储存条件（4°C避光冷藏、密封防蒸发、未冷冻、未干燥）下，R180可保持稳定超过3年。每次使用前检查溶液外观是否正常（均匀的红色悬浮液），如发现变色、沉淀无法重悬或瓶内液体已干涸，则不应继续使用。

 九、注意事项与安全信息

1. 本产品仅用于科学研究，不可用于人类或动物的临床诊断或治疗。

2. 操作时应穿戴实验服和一次性手套，避免直接接触皮肤或吸入气溶胶。

3. 注射操作应在生物安全柜或通风橱内进行，遵守动物实验伦理规范。

4. 产品不可冷冻，冷冻后微球将失效。

5. 产品不可干燥，干燥后无法重悬恢复。

6. 避免使用含甘油的封片剂，推荐Fluoromount™、Krystalon或专用抗淬灭封片剂。

7. 固定时避免使用戊二醛，推荐4%多聚甲醛。

8. 酒精和二甲苯透明步骤应控制在5分钟以内。

9. 如进行塑料包埋（plastic embedding），目前尚未证实能成功保留微球标记信号。

10. 废弃液应按照实验室生物废弃物处理规范处置。

 十、订购信息

R170 — Red Retrobeads™（经典款红色），规格 100 µl

R180 — Red Retrobeads™ IX（改进型红色），规格 100 µl

G180 — Green Retrobeads™ IX（改进型绿色），规格 100 µl

以上产品均为Lumafluor原厂出品，100 µl/支浓缩液包装。

中国区特约代理经销商为上海起发实验试剂有限公司，可通过其获取产品信息及采购。

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更多产品信息，请联系Lumafluor中国区域特约代理经销商：上海起发实验试剂有限公司

（注：本文内容基于品牌公开资料及行业常规信息整理，具体以品牌信息文档为准。）

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