Lumafluor Green Retrobeads™ IX (G180-100) 绿色逆向示踪荧光微粒 说明书

【产品描述】

货号：G180

英文名称：Green Retrobeads™ IX

中文名称：绿色逆向示踪荧光微粒（绿色逆行示踪微球）

品牌：Lumafluor, Inc.（美国）

规格：100 µl（液体悬浮液，浓缩原液）

荧光颜色：绿色

激发波长（Excitation）：约 480 nm

发射波长（Emission）：约 520 nm

核心成分：聚苯乙烯/聚甲基丙烯酸甲酯基微球，表面共价偶联绿色荧光染料

溶剂体系：水性悬浮液，含表面活性剂以维持分散稳定性

微球直径：约 0.02–0.2 µm（典型值，具体以批次检测报告为准）

浓度：约 10% 固体含量（w/v），可根据实验需求稀释

适用物种：大鼠、小鼠、非人灵长类及其他哺乳动物

应用领域：神经科学、神经解剖学、神经环路追踪、脑图谱绘制、神经元连接组学、药物递送研究

储存温度：4°C 避光保存

有效期：自生产日期起 12 个月（具体以瓶身标注为准）

原产国：美国

运输条件：冷藏运输（4–8°C）

安全提示：仅供科研使用，非临床用途；操作需佩戴防护手套与护目镜

中国区域供应商：上海起发实验试剂有限公司

【产品特点】

1. 高荧光强度与高信噪比

 微球内部包埋高浓度绿色荧光染料，荧光信号强，背景自发荧光低，在荧光显微镜下呈现明亮绿色荧光，便于低倍镜扫描与高倍镜精确定位。

2. 逆向（逆行）运输效率高

 微粒尺寸经优化设计，可被神经末梢高效内吞，并沿轴突逆向运输至胞体，实现"从靶区反推起源"的示踪策略，标记效率稳定可靠。

3. 长期体内稳定性

 荧光信号在固定组织中可保持数月不褪，适合长时程实验（数周至数月）。经醛类固定后荧光保留良好，兼容石蜡包埋与冰冻切片。

4. 低扩散、低泄漏

 微球被神经元内吞后不易逸出细胞膜，注射位点周围扩散范围小，标记边界清晰，可有效减少"假阳性"误判。

5. 与红色示踪剂高度互补

 绿色荧光通道（FITC/GFP 通道）与 Lumafluor 红色示踪微球（如 Red Retrobeads™ IX）光谱无重叠，可在同一组织中实现  双色或多色逆向示踪实验。

6. 即用型制剂

 产品为即用型液体悬浮液，无需溶解、复溶或复杂前处理，开瓶后  短暂涡旋混匀即可上样，节省实验准备时间。

7. 表面化学性质可控

 微球表面经过修饰处理，具有适度的亲水性与表面电荷，既保证注射顺畅不易堵塞针头，又促进神经末梢的有效摄取。

【储存条件】

1. 推荐储存温度：4°C ± 2°C（标准冰箱冷藏室）

2. 避光保存：建议使用铝箔包裹瓶身或存放于不透光容器中，避免荧光染料因光照而光漂白

3. 严禁冷冻：冷冻会导致微球聚集、破裂或荧光淬灭， 解冻后可能出现不可逆的沉淀

4. 防止干燥：使用后务必拧紧瓶盖，避免溶剂蒸发导致浓度改变或微球干结

5. 洁净操作：每次取用前短暂涡旋（5–10 秒）混匀悬浮液；建议使用无菌枪头，避免交叉污染

6. 有效期：开封后建议在 6 个月内使用完毕；未开封状态下按标注有效期执行

【工作原理】

G180 的工作原理基于"逆向轴突运输"（Retrograde Axonal Transport）机制：

第一步 — 注射与沉积

将 G180 悬浮液注射至目标脑区或外周神经靶区。微球以高浓度悬浮状态沉积在注射位点周围的组织间隙中。

第二步 — 神经末梢摄取

沉积在靶区的微球被该区域神经末梢通过胞吞作用（endocytosis）主动摄取。微球尺寸经过优化，既足够小以进入内吞途径，又足够大以避免快速被胞吐排出。

第三步 — 逆向运输至胞体

被摄取的微球包裹于内体/溶酶体囊泡中，借助微管马达蛋白（dynein 复合物）沿轴突以逆向方向运输，最终抵达神经元的胞体（soma），在细胞核周围富集。

第四步 — 荧光检测

携带绿色荧光微球的神经元胞体在荧光显微镜下呈现明亮绿色荧光。由于微球不透过细胞膜，信号被"锁定"在阳性神经元内部，背景干净。

研究者可据此：

· 确定支配该靶区的所有上游神经元群体

· 绘制脑区之间的连接图谱

· 结合其他示踪剂进行多色环路分析

第五步 — 长期保留

微球在神经元胞体内可长期驻留（数周至数月），荧光信号衰减缓慢，适合长时程追踪实验。固定后荧光保留良好，可存档反复观察。

【解决的实验问题】

问题一：传统顺行示踪剂标记方向单一

许多经典示踪剂（如 PHA-L、BDA）主要实现顺行标记，难以回答"哪些脑区投射到此处"的问题。G180 提供逆向视角的补充方案。

问题二：病毒示踪剂耗时长、操作复杂

病毒载体（如 rabies、HSV）需要数天至数周的扩增表达周期，且涉及生物安全等级要求。G180 注射后数天即可检测，无需病毒操作设施。

问题三：荧光染料扩散范围大、定位不准

游离荧光染料（如 Fluoro-Gold、DAPI 等）注射后易沿针道或组织间隙扩散，标记边界模糊。G180 微球颗粒大、扩散受限，注射位点紧凑，标记精度更高。

问题四：信号持续时间不足

部分染料在固定或包埋过程中荧光严重衰减。G180 微球荧光稳定，兼容甲醛/多聚甲醛固定、蔗糖沉糖、OCT 包埋、冰冻切片及后续免疫组化染色。

问题五：多色示踪光谱串扰

在双色或多色实验中，不同示踪剂的光谱重叠会导致通道串扰。G180 的绿色荧光与红色 Retrobeads 光谱分离良好，可在同一张切片上清晰区分两种标记群体。

问题六：注射操作不便

部分示踪剂为干粉形式，需自行配制且浓度难以控制。G180 为即用型液体，浓度均一，注射体积可控，重复性好。

【使用方法】

以下为典型的大鼠脑内注射操作流程，研究者可根据实际实验方案进行调整。

步骤一：准备工作

· 从 4°C 冰箱取出 G180，室温平衡 10–15 分钟

· 涡旋混匀 10 秒，确保微球均匀悬浮

· 如需要稀释，使用提供的稀释液或 0.01 M PBS（pH 7.4）

· 准备立体定位仪、微量注射器（建议 1–10 µl 规格）、 30–33 G 注射针头

步骤二：动物麻醉与固定

· 按机构动物伦理委员会批准的方案实施麻醉

· 将动物固定于立体定位仪，保持头部稳定

· 常规消毒手术区域

步骤三：开颅/暴露注射靶点

· 沿中线切开头皮，剥离骨膜

· 使用颅骨钻在目标坐标处开一小孔（直径约 1–2 mm）

· 避免损伤硬脑膜及大脑皮层表面血管

步骤四：装载示踪剂

· 用微量注射器吸取适量 G180 悬浮液

· 排出气泡，确认针尖有液体流出

· 记录装载体积

步骤五：缓慢注射

· 将针头缓慢下降至目标深度（典型速度 0.5–1 mm/min）

· 到达靶点后，以缓慢恒速注射（典型速率 0.1–0.5 µl/min）

· 大鼠常用注射体积：0.2–1.0 µl/位点

· 小鼠常用注射体积：0.05–0.3 µl/位点

· 注射完毕后留针 5–10 分钟，以减少回流

步骤六：拔针与缝合

· 以缓慢速度（约 1 mm/min）拔出针头

· 缝合头皮切口，消毒伤口

· 将动物置于温暖环境中苏醒

步骤七：存活期

· 典型存活时间：注射后 3–14 天（依实验目的而定）

· 较短存活期（3–5 天）适合快速运输实验

· 较长存活期（7–14 天）适合长距离逆向运输或稀疏投射研究

· 期间正常饲养，观察动物状态

步骤八：灌注固定与切片

· 深度麻醉动物，经心脏灌注生理盐水冲洗血液

· 灌注 4% 多聚甲醛（PFA）固定组织

· 取脑，后置固定于 4% PFA 中 4–24 小时

· 转移至 20%–30% 蔗糖溶液沉糖至组织沉底

· 冰冻切片（典型厚度 30–50 µm），贴片于载玻片

步骤九：封片与观察

· 使用含 DAPI 的荧光封片剂封片（便于复染细胞核）

· 盖玻片封固，指甲油封边

· 荧光显微镜下使用 FITC/GFP 滤光片组观察绿色荧光

· 激发光 480 nm，发射光 520 nm

· 拍照记录，注意控制曝光时间以避免光漂白

【常见问题与解决方案】

问题一：荧光信号弱或检测不到

· 可能原因：注射体积不足、存活时间过短、注射位点偏离目标、 微球未充分混匀、显微镜滤光片不匹配

· 解决方案：增加注射体积至推荐范围上限；延长存活期至 7 天以上；确认立体定位坐标准确性；注射前充分涡旋；确认使用FITC/GFP 通道观察

问题二：背景自发荧光高

· 可能原因：醛类固定剂（特别是戊二醛）产生组织自发荧光、封片剂含荧光杂质、切片过厚

· 解决方案：使用低自发荧光的封片剂；如必须含醛固定，可尝试处理切片以降低醛类自发荧光；控制切片厚度在30–40 µm

问题三：注射位点扩散范围过大

· 可能原因：注射速度过快、注射体积过大、针头口径过粗、留针时间不足

· 解决方案：降低注射速率至 0.1 µl/min 以下；减少注射体积；使用更细的针头（32–33 G）；延长留针时间至 10 分钟

问题四：荧光信号快速淬灭

· 可能原因：观察时激发光过强、暴露时间过长、未使用抗淬灭封片剂

· 解决方案：使用抗荧光淬灭封片剂（如含 DABCO 或ProLong Gold 的产品）；降低激发光强度；缩短单次曝光时间；尽快拍照存档

问题五：微球堵塞针头

· 可能原因：微球浓度过高、针头过细、悬浮液静置过久产生沉降

· 解决方案：注射前充分涡旋并间歇振荡；可使用适当稀释的悬浮液；避免静置超过 30 分钟；必要时更换更大口径针头

问题六：阳性细胞数量少

· 可能原因：靶区神经末梢密度低、投射通路稀疏、运输距离过长、动物品系差异

· 解决方案：增加注射位点数量（多点注射）；延长存活期；适当增大注射体积；参考同类文献确认预期标记强度

问题七：免疫组化染色效果不佳

· 可能原因：固定过度导致抗原表位遮蔽、抗体浓度不当、通透步骤不充分

· 解决方案：控制固定时间在 4–24 小时内；优化抗体滴定；使用 0.3% Triton X-100 通透 30 分钟；进行抗原修复 处理

问题八：与其他荧光标记串扰

· 可能原因：滤光片带宽过宽、多色标记光谱重叠

· 解决方案：使用窄带滤光片；合理安排多色实验的通道分配；采集时分离通道逐一拍照后合成

【注意事项】

1. 本产品仅供科研使用（For Research Use Only），不得用于临床诊断或治疗

2. 操作时请佩戴防护手套、护目镜及实验服

3. 避免吸入气溶胶或接触皮肤、黏膜

4. 如悬浮液不慎接触皮肤，立即用大量清水冲洗

5. 严禁冷冻保存，冷冻会导致微球不可逆聚集

6. 每次取用前务必涡旋混匀，确保微球均匀分散

7. 建议使用低自发荧光的试剂和耗材，以降低背景干扰

8. 荧光观察时尽量缩短曝光时间，延长样本可观察寿命

9. 不同批次间荧光强度可能存在微小差异，建议同一实验组使用同一批次产品

10. 废弃样本及耗材请按照实验室生物废弃物处理规范处置

【参考文献】

1. Katz LC, Iarovici DM. Green fluorescent latex microspheres:  a new retrograde tracer. Neuroscience. 1990;34(2):511-520.

2. Lanciego JL, Wouterlood FG. A half century of tracing neuronal connections with horseradish peroxidase and fluorescent substances. J Chem Neuroanat. 2011;42(4):157-161.

3. Schmued LC, Fallon JH. Fluoro-Gold: a new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties. Brain Res. 1986;377(1):147-154.

4. Wessendorf MW. Fluoro-Gold: composition, stability and suitability for retrograde labeling. J Neurosci Methods. 1991;38(1-2):1-17.

5. Veenman CL, Reiner A, Honig MG. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies. J Neurosci Methods. 1992;41(3):239-254.

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更多产品信息，请联系Lumafluor中国区域特约代理经销商：上海起发实验试剂有限公司

（注：本文内容基于品牌公开资料及行业常规信息整理，具体以品牌信息文档为准。）

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