Lumafluor Red Retrobeads™（ R170-100）红色逆行示踪荧光微球 说明书

一、产品描述

货号： R170（部分代理商标注为78R170或R170-100）

英文名称： Red Retrobeads™

中文名称： 红色逆行示踪荧光微球

品牌： Lumafluor

规格： 100 μl/支

浓度： 约1×10⁹ beads/ml

微球直径： 10 μm ± 0.5 μm

荧光染料类型： 磺酰罗丹明B衍生物（Sulforhodamine B derivative），属于罗丹明类红色荧光染料

光谱特性： 最大激发波长约530 nm，最大发射波长约590 nm

包装形式： 浓缩微球悬浮液，悬浮介质为蒸馏水，密封于避光小瓶中

产品类别： 神经元逆行示踪剂（Retrograde Tracer）

产地： 美国

货期：现货

中国区供应商：上海起发实验试剂有限公司 

产品定位： R170是Lumafluor公司RetroBeads™系列中的经典款红色荧光逆行示踪微球，是该系列中较早被广泛使用、文献引用量较大的基础型号。与进阶款R180（Red IX Retrobeads™）和旗舰款G180（Green IX Retrobeads™）共同构成Lumafluor的RetroBeads™产品矩阵。

二、产品特点

1. 高度局限的注射扩散特性

R170微球注射后在注射部位的扩散范围通常小于1毫米，这一特性使其非常适合用于精细神经连接研究。注射位点高度集中，不易弥散到邻近的非目标结构，从而显著降低误标风险，提高神经环路定位的精准度。

2. 信号强度高，单颗粒可见

每一个微球内部包裹了大量磺酰罗丹明B染料分子，单个微球在荧光显微镜下即可呈现明亮的红色荧光信号。即使在低浓度条件下，也能保持较高的检测灵敏度。

3. 体内长期稳定性

文献报道和厂家实验数据均表明，R170微球在活细胞或活体组织内可稳定存在超过14个月，荧光强度和标记质量在此期间未见明显下降。部分研究推测其标记可能是接近长期性的。这一特性使其适用于需要长存活期的慢性实验设计。

4. 生物相容性好，无明显毒性

截至目前，未见R170微球对实验动物或神经元产生毒性作用的报道。该产品支持在清醒动物上进行在体实验，适合长期纵向研究。

5. 与多种实验技术兼容

R170可与大多数顺行示踪剂联合使用，实现多色或多方向神经环路示踪。同时，它与原位杂交（in situ hybridization）、免疫组织化学（immunohistochemistry）等技术兼容，可在同一批切片上进行多重标记实验。

6. 光谱独立性

R170的红色荧光通道（激发约530 nm / 发射约590 nm）与绿色荧光蛋白（GFP）、黄色荧光蛋白（YFP）等常用荧光标记无显著光谱重叠，便于在同一样本中实现多色荧光成像。

7. 文献支撑充分

Lumafluor的RetroBeads™系列产品经数百篇已发表研究论文验证，研究对象涵盖从无脊椎动物到灵长类动物的广泛物种体系，是逆行示踪领域被文献引用较多的荧光微球产品之一。

三、储存条件

推荐储存温度： 4°C冷藏保存。

避光要求： 建议在避光或暗处保存，避免荧光染料因长期光照而淬灭。

防蒸发措施： 珠溶液应存放于密封良好的容器中，防止水分蒸发导致微球浓度改变或干涸。建议在冰箱内放置于加湿容器中进一步降低蒸发风险。

严禁冷冻： 绝对禁止将R170微球冷冻保存。冷冻会导致微球结构破坏、荧光淬灭，冻结后的产品无法恢复活性，不可继续使用。

干燥后不可复溶： 若微球因密封不严等原因发生干燥，无法重新悬浮恢复，相应产品即告失效。

有效期： 在严格遵循上述储存条件的前提下，R170可保持数年稳定。厂家未明确标注固定有效期，但建议在到货后一年内使用完毕以获得最佳实验效果。

四、工作原理

R170 Red Retrobeads™的工作原理基于神经元末梢的胞吞作用（endocytosis）和轴突逆行转运（retrograde axonal transport）机制。

第一步：末梢摄取

将R170微球悬浮液注射到目标脑区或神经核团后，微球被局限在注射位点附近（扩散范围通常小于1毫米）。该区域的神经元轴突末梢通过胞吞作用将微球颗粒摄取进入细胞内。

第二步：逆行轴突运输

摄取了微球的末梢启动逆行转运程序，微球沿轴突被运输回神经元的胞体（soma）区域。这一过程依赖细胞内的微管马达蛋白（主要为动力蛋白dynein）驱动。

第三步：胞体沉积与长期留存

微球到达胞体后沉积在细胞质中，形成明亮、稳定的红色荧光标记。由于微球被包裹在聚苯乙烯聚合物壳体内，染料分子不会从微球中泄漏，也不会被细胞代谢降解，因此标记可在胞体内长期保留。

第四步：荧光检测

在荧光显微镜下，使用罗丹明滤光片组（激发约530-550 nm，发射约570-600 nm）即可观察到标记神经元的红色荧光信号。每个被标记细胞的胞体内可见多个明亮的红色荧光点。

这一机制使研究者能够通过检测远端脑区中的荧光标记细胞，反推该脑区向注射位点投射的神经元的空间分布，从而绘制神经连接图谱。

五、解决实验中的哪些问题

1. 神经环路连接图谱绘制

R170帮助研究者确定"哪些脑区的神经元向目标区域发送投射"，是解析大脑神经网络拓扑结构的基础工具。通过在不同脑区注射R170并检测远端标记细胞，可系统绘制脑区间的投射图谱。

2. 注射位点的高精度定位需求

传统示踪剂（如荧光染料CTB、Fluoro-Gold等）在注射后容易沿针道或组织间隙扩散，导致标记范围模糊。R170的微球物理形态使其注射后扩散极小，能够精确定位到亚毫米级别的核团边界，适合需要高空间分辨率的连接组学研究。

3. 长程投射的慢性追踪

部分示踪剂在体内的存留时间有限，不适合需要较长存活期的实验。R170可在体内稳定存在超过一年，适用于需要数周甚至数月存活期的长程投射研究、神经发育追踪、以及移植神经元的长期整合监测。

4. 多色组合示踪

R170的红色通道与GFP/YFP等绿色荧光标记互不干扰，可与绿色RetroBeads（G180）联合使用，实现双色逆行示踪，分别标记两个不同靶区的输入神经元。

5. 与免疫组化/原位杂交的联合检测

R170标记不影响后续免疫组化染色或原位杂交实验的操作流程，可在同一张切片上同时进行荧光微球逆行标记和特定蛋白/基因的表达检测，实现"投射来源+分子身份"的双重鉴定。

6. 大范围核团标记

虽然单次注射扩散范围小，但R170可通过多点位注射策略标记投射到较大核团的神经元群体，配合立体定位技术实现系统性覆盖。

六、使用方法

第一步：实验前准备

从4°C冰箱中取出R170小瓶，在室温下静置片刻使溶液温度回升。轻柔摇匀或涡旋混匀微球悬浮液，确保微球均匀分布。不建议超声处理，以免破坏微球结构。

第二步：稀释（如需要）

对于初次实验，强烈建议使用原液（不稀释）进行注射，以确保单位体积内微球数量充足，获得可靠的标记效果。在部分脑区（如大鼠视皮层）的实验中，1:4稀释未观察到标记质量下降，但这一比例需根据具体实验脑区和物种进行调整。可使用蒸馏水或常规盐溶液（NaCl、KCl溶液）作为稀释液。注意：绿色RetroBeads不建议稀释，R170如需稀释应做好预实验验证。

第三步：立体定位注射

将实验动物麻醉后固定于立体定位仪上，按照目标脑区的标准立体定位坐标调整注射针位置。推荐使用压力注射系统，如1 mL Hamilton微量注射器或气动注射装置。

注射量参考：局部微小区域注射可使用30-50 nL，注射针直径约30-50 μm；常规逆行示踪注射量为0.1-0.3 μL，可使用较大口径的玻璃微量移液管。

注射速度应缓慢均匀，注射完毕后留针5-10分钟再缓慢退针，以减少微球沿针道回流。

第四步：多点注射策略

由于R170在注射后扩散范围小（<1 mm），对于较大的目标核团，需要进行多个位点的注射以充分覆盖目标区域。注射位点数量和间距应根据核团大小和形态进行合理规划。

第五步：术后存活

在大多数恒温脊椎动物（小鼠、大鼠等）中，最短有效存活时间约为24小时。标记强度在48小时内随存活时间增加而增强，48小时后趋于稳定。建议常规存活期为5-7天。对于远距离投射或大型动物，可适当延长存活期。冷血动物建议存活期设为1周。

第六步：灌注固定

动物深度麻醉后，用0.1 M磷酸缓冲液（PBS，pH 7.4）进行心脏灌注冲洗血液，随后用4%多聚甲醛（PFA，溶于0.1 M磷酸缓冲液，pH 7.4）灌注固定。灌注量一般为50-100 mL（小鼠）或200-300 mL（大鼠），具体根据动物体重调整。

重要提醒： 避免使用戊二醛（glutaraldehyde）作为固定剂。戊二醛会引起严重的组织自发荧光，显著干扰微球荧光信号的检测。在戊二醛固定的组织中，绿色微球可能全不可见。

第七步：后固定与切片

取脑后置于4% PFA中后固定2-4小时（小鼠）或过夜（大鼠），随后转入30%蔗糖溶液中进行冷冻保护，直至脑组织沉底。使用冰冻切片机将脑组织切成30-50 μm厚度的冠状或矢状切片。

第八步：贴片与封片

将切片用PBS漂洗后，贴附于明胶包被的载玻片上，室温空气干燥。全干燥后，用二甲苯透明1分钟，随后使用荧光封片剂（如Fluoromount或Krystalon）封片。

封片注意事项： 切片接触乙醇或二甲苯的时间不宜过长，超过5分钟可能损伤微球。严禁使用含甘油的封片剂，微球对甘油高度敏感，甘油会导致荧光快速淬灭。如无法避免使用甘油体系，可改用甲酯水杨酸（methyl salicylate）作为替代封闭介质。

七、荧光显微镜观察建议

滤光片选择： R170中的染料为罗丹明类，可使用任何标准罗丹明滤光片组进行观察。有用户反馈部分尼康老旧型号罗丹明滤光片背景较高，建议优先选用蔡司（Zeiss）或徕卡（Leica）的标准罗丹明滤光片组，可获得较理想的信噪比。

物镜选择： 低倍干镜（如4×、10×干镜）通常难以清晰分辨单个标记细胞。推荐使用10×油镜（数值孔径NA ≥ 0.4）或更高倍率的油镜进行观察。25×油镜可显著提升绿色微球（以及红色微球的细节）的成像清晰度。在判定实验是否失败之前，务必使用油镜检查注射位点附近的切片——该区域应存在大量局部标记细胞，可作为阳性对照参考。

光稳定性： R170在长时间连续观察和显微摄影过程中表现出良好的抗光漂白特性，荧光信号不易因光照而快速衰减。

八、常见问题与解决方案

问题一：注射后未观察到标记细胞

可能原因包括：注射位点偏离目标核团、存活时间不足、微球浓度过低（如过度稀释）、固定或切片过程中微球丢失。

解决方案：首先用油镜检查注射位点附近切片，确认是否存在局部标记细胞。若注射位点有标记但远端无标记，需核实立体定位坐标是否准确、存活时间是否足够（至少24小时，建议5-7天）。若注射位点也无标记，可能是微球失效或注射系统堵塞，建议检查注射器通畅性并确认产品储存条件是否合规。

问题二：标记信号弱

可能原因：微球稀释比例过高、注射量不足、存活时间过短、物镜倍率或滤光片不匹配。

解决方案：初次实验使用原液而非稀释液；适当增加注射量或在目标核团内增加注射位点数；确保存活期不少于5天；换用高数值孔径油镜并确认滤光片组匹配罗丹明光谱。

问题三：背景荧光高，信噪比差

可能原因：使用了戊二醛固定、组织自发荧光强、封片剂选择不当、切片过厚。

解决方案：固定过程严格使用4% PFA，避免戊二醛；优先选用幼年动物（组织自发荧光较低）；使用薄切片（如30 μm而非40-50 μm）；封片后尽快观察（背景荧光会随时间增强）；选择高信噪比的封片剂。

问题四：微球扩散到非目标区域，导致误标

可能原因：注射量过大、注射速度过快、留针时间不足导致微球沿针道反流。

解决方案：降低单次注射体积，增加注射位点数量以实现均匀覆盖；减慢注射速度；注射完毕后延长留针时间（10-15分钟）再缓慢退针。

问题五：微球在储存后出现沉淀或结块

可能原因：储存温度不当（如冷冻）、密封不严导致蒸发干燥、长期静置未混匀。

解决方案：R170必须4°C冷藏、密封、避光保存，严禁冷冻。每次使用前轻柔摇匀。若发现不可逆结块或沉淀性状明显改变，建议联系供应商确认是否仍可使用，必要时更换新产品。

问题六：与免疫组化联用时信号互相干扰

可能原因：荧光二抗与R170红色通道光谱重叠、抗体浓度过高导致背景升高。

解决方案：选择荧光二抗时避开红色通道（如选用488 nm绿色通道或647 nm远红色通道的二抗）；每批实验设置阴性对照（未注射侧组织或未注射动物）以评估背景水平；优化抗体稀释比例。

问题七：无法用离子电渗法（iontophoresis）成功递送微球

原因分析：虽然R170微球带有净负电荷，但离子电渗法并不是有效的递送方式，微球粒径较大，电渗效率很低。

解决方案：坚持使用压力注射方式递送R170，不尝试离子电渗法。

九、注意事项与安全信息

本产品仅限科研用途，不可用于人体临床诊断和治療。操作过程中建议佩戴手套和护目镜，避免直接接触皮肤或眼睛。废弃微球溶液应按照实验室生物废弃物处理规范进行处置。使用过程中如不慎溅入眼睛，应立即用大量清水冲洗并就医。

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更多产品信息，请联系Lumafluor中国区域特约代理经销商：上海起发实验试剂有限公司

（注：本文内容基于品牌公开资料及行业常规信息整理，具体以品牌信息文档为准。）

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