3'-Amino-Modifier C7 CPG 1000（20-2958）Glen Research产品说明书

一、产品描述

1. 货号：20-2958

2. 英文名称：3'-Amino-Modifier C7 CPG 1000

3. 中文名称：3'端C7氨基修饰可控孔玻璃（CPG）、3'端氨基修饰C7 CPG 1000Å、3'端伯胺功能化C7载体

4. 品牌：Glen Research

5. 化学名称：(2-二甲氧基三苯甲基氧甲基-6-芴甲氧羰基氨基己烷-1-琥珀酰)-长链烷氨基-CPG

6. 分子量：209.18

7. 孔径：1000Å

8. 规格选项：根据产品目录，常见规格包括1.0 g、0.1 g散装CPG，以及1 x 10 µmol、1 x 15 µmol、4 x 1.0 µmol、4 x 0.2 µmol等预装柱规格。具体包装形式（散装或预装）可依据实验需求及区域代理商库存情况选择。若无特殊说明，品牌通常提供ABI风格预装柱，其他仪器接口或空柱填装需求需在订购时明确。

9. 产品概述：本品是一种用于寡核苷酸固相合成的修饰型固体支持物。其表面通过长链烷氨基连接臂引入伯胺功能团，且该伯胺由碱可脱除的Fmoc（芴甲氧羰基）保护。支持物同时带有DMT（4,4'-二甲氧基三苯甲基）保护基团，因此可像常规受保护核苷CPG一样直接装入合成柱并参与自动或手动固相合成。该产品旨在为合成后的寡核苷酸在3'端提供可进一步偶联的伯胺，便于后续与荧光染料、生物素、多肽、蛋白质或其他小分子进行连接。

二、产品特点

1. 3'端定向修饰：通过在合成起始支持物上预设氨基连接臂，可在寡核苷酸3'端特异性引入伯胺，避免5'端修饰可能带来的空间位阻或影响引物延伸、酶切反应等后续操作。

2. C7长度连接臂：连接臂中包含C7长度的间隔单元，使3'端伯胺与寡核苷酸主链之间保持一定距离，有助于降低后续偶联标签与核酸骨架之间的空间位阻，提高标记效率。

3. Fmoc保护基：氨基采用Fmoc保护，该保护基在亚磷酰胺合成循环中表现稳定，可避免伯胺在偶联、氧化、封端等步骤中提前参与反应。合成结束后，Fmoc可通过氨解或选择性碱处理去除，暴露出游离伯胺。

4. 含DMT基团：支持物带有DMT保护，起始去DMT后可通过三苯甲基阳离子颜色或仪器监测来判断去保护效率，便于与普通核苷合成循环衔接。

5. 1000Å大孔径：1000Å的孔径设计有助于改善较长寡核苷酸链在固相孔道内的扩散与合成效率，适用于中长链DNA、RNA及部分修饰序列的合成。

6. 灵活的偶联策略：既可在合成后通过溶液相偶联将标签连接到3'端氨基上，也可在固相合成仪上通过选择性去Fmoc后进行固相偶联，为实验设计提供多种选择。

三、储存条件

1. 温度要求：本产品建议冷冻保存，推荐温度范围为-10℃至-30℃。

2. 环境湿度：储存环境应保持干燥，避免湿气侵入。CPG为多孔固体材料，吸湿后可能导致表面官能团稳定性下降、结块或影响装柱效果。开封后应在干燥操作环境中分取所需用量，剩余产品需在原容器中密封，并继续置于冷冻条件下保存。

3. 隔离存放：产品应避免与强酸、强碱、强氧化剂、游离胺类试剂及不明有机溶剂共同存放，以防交叉污染或发生非预期反应。

4. 文件遵循：若产品附带安全数据表（SDS）、技术证书（COA）或批号对应的技术文件，其中对储存温度、保质期、装载量等有更具体说明的，应以对应批号文件为准。

5. 记录管理：实验室接收产品后，建议记录到货日期、批号、规格、开封时间及分装情况，以便于后续合成实验的追溯和效果评估。

四、工作原理

1. 合成起始：将装有本品的合成柱接入合成仪，首先进行去DMT操作，去除起始位点的DMT保护基，暴露出自由羟基。

2. 链延伸：按照预设序列从3'端向5'端依次加入碱基亚磷酰胺单体（dA、dT、dC、dG或相应的RNA碱基、修饰核苷），经过偶联、封端、氧化（或硫化）等步骤，使寡核苷酸链逐步延长。在整个合成循环中，3'端连接臂内的伯胺由Fmoc保护，不会参与反应，从而保持封闭状态。

3. 切割与脱保护：合成结束后，采用氨水在室温下处理约2小时，将寡核苷酸从支持物切割下来。随后根据所使用碱基保护基的种类，完成完整的脱保护过程。Fmoc保护基在氨解条件下会同步脱除，或者在特定条件下（如使用哌啶/DMF）选择性去除，从而在3'端暴露出伯胺（-NH2）。

4. 后续偶联：暴露的伯胺可与NHS酯（N-羟基琥珀酰亚胺酯）、异硫氰酸酯、醛酮类化合物等发生共价连接，实现荧光标记、生物素化、多肽偶联、表面固定等功能化操作。由于氨基位于3'端，这种修饰具有明确的端点定向性。

五、解决实验中哪些问题

1. 敏感标签的直接合成难题：部分荧光染料、淬灭剂、生物素、多肽、蛋白质、脂质或小分子药物没有对应的亚磷酰胺单体，或者在固相合成的酸性去DMT、偶联试剂、脱保护条件下不稳定。使用本品，可先合成3'端氨基寡核苷酸，再通过合成后偶联的方式引入这些敏感标签，降低标签降解风险。

2. 端点定向修饰需求：某些实验要求功能团仅出现在寡核苷酸的3'端，以避免影响5'端的酶处理（如磷酸化、连接酶反应）、杂交或引物延伸。本品可提供3'端特异性的伯胺，实现端点定向标记或固定。

3. 空间位阻导致的偶联效率低：当标签分子较大或需要多个标签时，直接连接在碱基或末端时可能因空间位阻而影响反应效率。C7连接臂提供了一定的空间伸展，有助于缓解这一问题。

4. 表面固定与生物偶联：在制备DNA芯片、固定化探针、磁珠捕获系统或纳米材料共轭物时，3'端伯胺可通过EDC/sNHS活化、马来酰亚胺-硫醇交换、醛基偶联等方式与羧基化表面、活化酯表面或功能化基底结合，为表面化学提供灵活的接口。

5. 双修饰探针的构建：对于需要同时在5'端和3'端引入不同报告分子（如FRET探针）的实验，本品可与5'端修饰单体配合，分别承载不同功能团，减少同一端点多个标签造成的空间竞争和合成难度。

6. 保护基策略的选择：文档中提及另一种3'端氨基修饰采用邻苯二甲酰亚胺（PT）保护基（如3'-PT-Amino-Modifier C3/C6 CPG）。PT保护基在合成中非常稳定，但脱保护需要较为剧烈的条件（55°C氨水处理17小时）。本品采用Fmoc保护，脱保护条件相对温和，适用于对强碱长时间处理敏感的修饰序列。用户可根据实验条件、序列长度及修饰类型选择合适的保护基类型。

六、使用方法

1. 装柱与准备：若使用散装CPG，应在干燥环境（如干燥器或低湿度操作台）中称取适量支持物，装入与合成仪匹配的空柱中，并安装合适的滤膜。装填时避免过紧，以免影响试剂流通和合成效率。若使用预装柱，需核对货号、规格、仪器兼容性及有效期。

2. 固相合成：将本品按常规受保护核苷支持物的方式接入合成程序。由于支持物含有DMT基团，起始去DMT步骤可使用合成仪常规试剂，并通过监测三苯甲基阳离子颜色判断去保护程度。随后，按照目标序列依次进行碱基偶联、封端、氧化/硫化、洗涤等循环。C7连接臂本身不提供碱基，因此3'端起始位点无需额外添加碱基单体；序列内部位点仍按标准亚磷酰胺化学合成。

3. 切割与脱保护：合成结束后，进行寡核苷酸切割。推荐使用氨水在室温下处理约2小时以将寡核苷酸从支持物上切割下来。切割完成后，需根据所使用碱基保护基的要求，完成完整的脱保护步骤。若序列中包含对强碱或高温敏感的修饰，应参考对应单体的技术文件调整脱保护条件，避免损伤寡核苷酸。

4. 选择性去Fmoc与固相偶联：若希望在切割前于固相上直接进行标记，可采用选择性去Fmoc方法。通常使用20%哌啶/DMF溶液冲洗柱子，室温作用数分钟，重复数次以全去除Fmoc保护基。随后用DMF、乙腈等充分洗涤，再加入溶解于无水DMF的NHS酯类标签（可加入适量有机碱如DIEA催化），室温孵育一定时间。标记完成后，再按上述条件进行切割和全局脱保护。该方法可减少溶液中游离胺的干扰，但需严格控制洗涤和反应条件。

5. 溶液相偶联（合成后标记）：更常用的策略是先进行切割和脱保护，获得3'端氨基寡核苷酸，再进行溶液相偶联。将寡核苷酸溶解于无胺缓冲液中，如0.1 M碳酸氢钠（pH 8.3-8.5）或0.1 M硼酸盐缓冲液（pH约8.5）。将NHS酯类染料或生物素等溶于无水DMF或DMSO，加入寡核苷酸溶液中，避光反应数十分钟至数小时。反应后，通过凝胶过滤、反相HPLC、透析或沉淀等方法纯化产物，去除未反应的标签和杂质。需注意，偶联缓冲液中不应含有Tris、甘氨酸、铵盐等含游离胺的成分，以免影响偶联效率。

6. 纯化与鉴定：偶联产物可根据标签性质选择适当的纯化方法。使用紫外吸收（260 nm）估算寡核苷酸浓度，通过质谱（MS）确认分子量增量以验证修饰成功，利用荧光分光光度计、凝胶电泳或功能实验评估标记效率和生物活性。

七、常见问题与解决方案

1. 问题：3'端氨基偶联效率偏低。解决方案：可能原因包括Fmoc在合成过程中提前脱落，暴露的伯胺在封端步骤被乙酸酐乙酰化而失活；氨解不全导致Fmoc残留；偶联缓冲液中含有游离胺（如Tris）；NHS酯已水解；标签疏水性过强未充分溶解。可优化合成程序，起始循环避免过度封端；确保氨解条件充分，必要时通过质谱验证Fmoc去除；偶联前将寡核苷酸转为无胺形式；NHS酯现配现用，先以少量DMF/DMSO全溶解；控制偶联pH在8.3-8.5之间。

2. 问题：检测到乙酰化杂质（如N-乙酰化寡核苷酸）。解决方案：可能原因是Fmoc部分脱落导致游离胺被乙酸酐封端。若计划进行合成后溶液偶联，应确保合成全程Fmoc完整，采用标准氨解一次性去除Fmoc；若进行固相偶联，应在哌啶处理前避免不必要的封端循环。

3. 问题：氨解后碱基保护基未全去除。解决方案：可能原因是脱保护时间或温度不足，或特殊碱基保护基需要更强条件。应根据碱基单体技术文件执行补充脱保护；对于长序列、高GC含量或特殊修饰，可优化氨解温度与时间，但不宜盲目延长强碱处理，以免损伤核酸。

4. 问题：固相去Fmoc后标记不均一。解决方案：可能原因是哌啶渗透不均、装柱过紧、洗涤不够、标签在DMF中不稳定。应装柱松紧适度；采用多次短促哌啶处理而非单次长时间处理；每次处理后充分洗涤；可通过监测301 nm处Fmoc芴烯加合物吸光度评估去保护程度。

5. 问题：表面固定效率低。解决方案：可能原因是3'端氨基未全去保护、表面活化不足、固定缓冲液含胺、pH不当。应确认寡核苷酸为游离伯胺形式；优化表面活化条件（如EDC/sNHS浓度、反应时间）；固定后使用封闭剂处理未反应位点；设置对照实验量化固定密度。

6. 问题：长序列或敏感修饰下3'端氨基得率下降。解决方案：1000Å孔径虽有助于传质，但极长序列或密集修饰仍可能影响合成效率；氨解条件可能不适合某些敏感修饰。建议进行小试验证；考虑调整合成规模或选择其他孔径/连接臂长度的支持物；参考相关文献或技术公告优化条件。

7. 问题：Fmoc保护与PT保护如何取舍？解决方案：Fmoc保护脱除相对温和，适合一般标记和敏感序列；PT保护在合成中更稳定，但需强碱长时间处理（55°C 17小时），适合对Fmoc稳定性有疑虑的常规序列。可根据实验设备、序列特征和后续偶联化学选择。

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更多产品信息，请联系中国区域代理商：上海起发实验试剂有限公司

（注：本文内容基于品牌公开资料及行业常规信息整理，具体以品牌信息文档为准。）