Spermine Phosphoramidite（10-1939）Glen Research精子胺亚磷酰胺介绍

一、 产品描述

1.1 基础信息

货号：10-1939

英文名：Spermine Phosphoramidite

中文名：精子胺亚磷酰胺（也称精胺亚磷酰胺）

品牌：Glen Research

溶剂要求：无水乙腈（Anhydrous Acetonitrile）

1.2 化学特性与参数

完整化学名称：N¹-[4-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)butyl]-N¹,N4,N9,N¹²-tetrakis(trifluoroacetyl)-spermine-N¹²-butyl-4-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite

分子式：C56H73F12N6O9P

分子量（M.W.）：1233.17

目录分子量（F.W.）：408.52

CAS登记号：1969276-82-1

本产品是一种经过全保护的亚磷酰胺单体，专门用于固相合成寡核苷酸，通过引入精子胺（Spermine）单元来制备Zip Nucleic Acids（ZNA®）共轭物。其分子结构包含DMT羟基保护基、三氟乙酰（TFA）氨基保护基、2-氰乙基磷酸保护基以及二异丙基氨基活性基团，可在标准DNA/RNA合成仪上直接参与偶联反应。

1.3 包装规格

本产品提供以下三种标准包装规格，以满足不同规模的实验需求：

第一种：0.25 g包装。此规格适合较大规模或多批次的合成。按无水乙腈配制时，可参考合成仪兼容图表计算稀释体积，例如在ABI 392/394仪器上约需2.03 mL乙腈配制成0.1M溶液。

第二种：100 µmol包装。实际重量约为0.123 g，适合中等通量合成或方法学建立。在ABI 392/394仪器上建议用1 mL乙腈稀释。

第三种：50 µmol包装。实际重量约为0.062 g，适合小量探针开发、初次尝试或珍贵序列合成。在ABI 392/394仪器上建议用0.5 mL乙腈稀释。

所有规格的具体稀释体积和预计添加次数，均需参照所使用的合成仪型号（如ABI 392/394或Expedite等）的兼容图表进行最终确认。

二、 产品特点

1.本产品的最大特点是能够合成具有多阳离子特性的ZNA寡核苷酸。精子胺单元在脱保护后可形成多个正电荷中心，通过静电作用有效降低互补核酸链之间的排斥力，从而显著提高双链稳定性。

2.该产品与标准亚磷酰胺合成流程高度兼容。它可以在3'端或5'端进行单次或多次重复添加，灵活调节正电荷密度。推荐使用0.25M ETT活化剂，耦合时间约为2分钟，操作简便。

3.脱保护流程仅需增加一步预处理。在常规氨水切割和脱保护之前，使用10%二乙胺/乙腈处理5分钟即可去除氰乙基，随后按碱基要求用30%氨水处理，即可完成全部脱保护步骤，无需特殊合成柱或复杂后处理设备。

4.基于本产品合成的ZNA探针或引物，在提高杂交稳定性的同时，能够保持对单碱基错配的区分能力。这一特性使其在需要高特异性的分子诊断应用中表现出色，且不会像某些强稳定修饰那样全消除序列特异性。

三、 储存条件

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1.未配制产品的储存：原包装未开封产品应置于冷冻环境中保存，推荐温度为-10℃至-30℃，且必须保持干燥。亚磷酰胺类化合物对水分和高温非常敏感，开封后应尽快称量并密封，避免吸湿导致水解失效。

2.配制后溶液的稳定性：将产品溶于无水乙腈后，其溶液稳定性有限，数据表明在溶液中可稳定约1-2天。因此，建议现配现用，或将母液分装后短期存放于低温环境，避免反复冻融和长时间室温放置。若发现溶液出现浑浊、沉淀或颜色变化，应停止使用。

3.合成后产物的储存：经脱保护、纯化得到的ZNA干粉应在-20℃以下避光干燥保存。复溶后的溶液可根据实验频率选择4℃短期保存或-20℃长期分装保存，避免反复冻融引起降解或聚集。

四、 工作原理

1.天然DNA/RNA的磷酸骨架带有负电荷，两条互补链在接近时会产生静电排斥，尤其在短序列、低离子强度或AT丰富区域更为显著。Spermine Phosphoramidite通过共价连接将多个正电荷引入寡核苷酸末端。脱保护后，精子胺单元上的氨基质子化，形成多阳离子尾段。

2.ZNA的共轭物被认为通过“扫描与拉链"模型发挥作用。寡精子胺尾段与靶序列的磷酸骨架发生静电吸引，从而“扫描"并沿互补链滑动，直至找到全匹配的序列。一旦形成双链，阳离子尾段有效降低了链间静电排斥，起到“拉链"式稳定作用，显著提高双链melting temperature（Tm）。

3.对于短寡核苷酸，Tm随精子胺单元数的增加近似线性上升。经验公式Tm(ZNA) ≈ Tm(DNA) + 36z/(N-3.2) 可用于初步估算，其中z为精子胺单元数，N为寡核苷酸长度。但实际Tm值受缓冲液盐浓度、镁离子、pH及靶序列二级结构影响，需通过实验验证。

五、 解决实验中哪些问题

1.短引物Tm值过低：在PCR或qPCR中，短引物常因Tm偏低而需要降低退火温度，导致非特异性扩增。引入精子胺修饰可显著提高短引物的Tm，使退火温度更接近常规引物，从而改善特异性。

2.AT丰富区域扩增困难：AT碱基对仅形成两个氢键，双链稳定性较差。使用ZNA引物可通过静电稳定补偿AT区域的弱氢键，提高扩增效率，减少因解链过早导致的失败。

3.多重PCR中引物Tm差异大：多重PCR要求各对引物具有相近的退火温度。ZNA修饰可将某些短引物的Tm上调，使所有引物能在同一退火温度下工作，简化反应体系优化。

4.microRNA等短靶标检测：miRNA长度通常为20-24 nt，传统DNA探针杂交信号弱。ZNA探针可增强与短RNA靶标的结合，提高检测灵敏度，并可用于熔解曲线分析。

5.SNP分型与等位基因鉴别：ZNA在提高总体Tm的同时，能保持对错配的敏感性。全匹配与单碱基错配之间的Tm差值足以通过实时PCR或熔解曲线进行区分，适用于高通量SNP筛查。

6.反义核酸与细胞摄取：阳离子精子胺修饰可增强寡核苷酸与带负电的细胞膜或靶核酸的相互作用，部分研究还显示其能改善血清稳定性，为反义治疗或基因沉默实验提供工具。

六、 使用方法

6.1 合成前准备

确认合成仪状态良好，准备无水乙腈、0.25M ETT活化剂、封端试剂、碘氧化液、脱保护试剂等。在干燥环境中，将Spermine Phosphoramidite按所需浓度溶于无水乙腈。例如，0.25 g包装可加入约2.03 mL乙腈配成约0.1M溶液。小包装需按实际瓶标重量计算体积。

6.2 序列设计与添加位置

根据实验目的确定精子胺单元数（z）和添加位置。通常从3'端或5'端开始添加，可连续添加多个单元。需注意避免将修饰置于酶活性中心或探针的荧光报告基团附近，以免影响功能。对于PCR引物，若3'端延伸受阻，可改至5'端。

6.3 耦合步骤

将单体瓶装入合成仪，选择亚磷酰胺耦合程序。使用0.25M ETT活化剂时，设置耦合时间为2分钟。若使用其他活化剂或单体新鲜度下降，可适当延长耦合时间并监测DMT脱保护效率。对于多位点重复添加，建议每次添加后进行DMT检测，确保耦合效率。

6.4 脱保护流程

合成结束后，首先进行氰乙基去除：用10%二乙胺/乙腈溶液处理固相支持物，室温下静置5分钟，然后用乙腈充分冲洗。此步骤至关重要，可防止后续氨水处理时产生丙烯腈加合物。接着进行切割和碱基脱保护：使用30%氢氧化铵（氨水）按常规碱基保护基要求处理。由于TFA保护基较难去除，需保证室温下至少4小时，或55℃下约30分钟。处理完成后，蒸发氨水，得到粗产物。

6.5 纯化与复溶

粗产物可通过反相HPLC、离子交换或PAGE纯化。由于ZNA带正电，常规低pH反相缓冲液可能导致峰形展宽，建议使用高pH反相系统或专用纯化柱。纯化后冻干，用无核酸酶水或适当缓冲液复溶。若产物溶解度低，可尝试弱碱性缓冲液或含少量盐的溶液。

七、 常见问题与解决方案

1.耦合效率偏低：可能原因包括乙腈含水量高、活化剂失效、单体未全溶解、合成仪管路有水或支持物载量不足。解决方案为更换无水乙腈，检测水分含量；使用新鲜配制的0.25M ETT活化剂；确保单体充分溶解并过滤；检查合成柱是否干燥；适当增加耦合时间或单体当量。

2.脱保护不全或精子胺丢失：可能原因是氨水处理时间不足、温度不够、二乙胺预处理步骤遗漏。解决方案为严格按照10%二乙胺/乙腈5分钟预处理；氨水脱保护确保TFA全去除，可延长至室温过夜或适当提高温度；避免强酸或过度加热导致精子胺降解。

3.HPLC分析峰形异常或保留时间不稳定：可能原因是ZNA正电荷导致与固定相非特异性作用，低pH缓冲液抑制电离不足。解决方案为改用高pH反相缓冲液；使用耐碱色谱柱；或采用离子对反相色谱；纯化前可先进行脱盐处理。

4.多重PCR出现非特异性扩增或二聚体：可能原因是ZNA引物Tm过高导致退火温度需重新优化，镁离子浓度不匹配。解决方案为重新设计梯度PCR，确定最佳退火温度；根据ZNA引物的实际Tm调整镁离子浓度；必要时引入错配或缩短精子胺单元数以微调Tm。

5.产物溶解度差或聚集：可能原因是精子胺单元过多导致正电荷过强，在中性或低pH水中易聚集。解决方案为减少精子胺添加个数；使用弱碱性缓冲液复溶；或添加适量助溶剂；避免高浓度储存。

6.与其他修饰不兼容：可能原因是某些酸敏感、光敏感或超温和保护基修饰与氨水高温条件冲突。解决方案为查阅各修饰单体的脱保护要求，避免混用不兼容保护基；必要时采用分步合成或后合成偶联策略；进行小规模兼容性测试。

八、 合规与注意事项

1.研究用途声明：本产品仅限科学研究使用，不适用于临床诊断、治疗或人体实验。任何将本产品用于制造寡精子胺寡核苷酸共轭物并用于诊断、临床或商业应用的行为，需事先获得相关技术权人（如Polyplus Transfection SA）的授权许可。

2.该产品受美国分案技术申请14/745,871、欧洲EP 1973927 B1及相应国家/地区同族保护，Polyplus Transfection为共同所有人。

3.安全操作：产品涉及有机胺、氰乙基化合物及氨水，操作应在通风橱中进行，佩戴适当防护装备。避免接触皮肤或吸入挥发气体。废弃物应按照危险化学品处理规定处置。

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更多产品信息，请联系Glen Research中国区域代理商：上海起发实验试剂有限公司

（注：本文内容基于品牌公开资料及行业常规信息整理，具体以品牌信息文档为准。）