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mRNA体外转录原料

mRNA体外转录原料

更新时间:2022-04-13

访问量:103

厂商性质:经销商

生产地址:

简要描述:
mRNA疫苗的研发与生产需要一系列酶的参与:mRNAT7聚合酶、无机焦磷酸酶、RnaseInhibitor、加帽酶以及2′O-甲基转移酶、Poly(A)聚合酶和DNAase等主要7种酶。

起发生物提供全线mRNA体外转录原料

 

mRNA疫苗相关产品-起发生物

起发生物提供mRNA 核苷和酶原料 mRNA合成技术服务助力核酸药物,向世界产品看齐

关键词  mRNA 核苷 ,mRNA核心原料,高产量T7酶 ,高产率mRNA, mRNA合成,mRNA疫苗,mRNA药物,mRNA解决方案,mRNA定制,mRNA CRO,N1-UTP(甲基假尿苷),P-UTP,Pseudo-UTP(假尿苷)

mRN药物简介

基于mRNA的治疗,简单来讲就是利用化学修饰后的mRNA分子进入细胞质中,利用细胞质内的自有核苷酸进行转录表达,生成机体所需要的蛋白质。上世纪90年代,mRNA药效被初步证实,之后大量的精力投入到了mRNA药物的研发中。

mRNA药物开发的主要技术门槛在于稳定性和递送,若相关难点能够得以解决,mRNA药物就可作为蛋白质补充或替代疗法治疗相关疾病。尤其是随着癌症基因测序和抗原表位发现等技术的发展,mRNA药物也可用于针对肿瘤患者的个性化治疗,并具有巨大的应用潜力。目前在mRNA肿瘤药物开发领域进展较快的企业主要是Moderna、BioNTech和CureVac。

二、mRNA合成过程所需原料

(一)国内外mRNA X冠疫苗的合成工艺

BioNTech/辉瑞、Moderna和艾博生物mRNA疫苗的合成工艺如下:

1BNT162b2–BioNTech/辉瑞

三核苷酸cap1类似物((m27,3′-OGpppm2'-OApG)(TriLink)和N1-甲基假尿苷-5′-三磷酸(m1ψTP)(ThermoFisherScientific)取代尿苷-5′-三磷酸(UTP)的存在下,通过T7RNA聚合酶对DNA进行纯化和体外转录。

总结:转录采用一步法,帽子类似物作引物;甲基假尿苷取代尿苷。

2mRNA-1273–Moderna

利用优化的T7RNA聚合酶介导的转录反应在体外合成了编码序列优化的mRNA,尿苷被N1-甲基假尿苷完全取代。转录后,使用牛痘苗封盖酶(新英格兰生物实验室)和痘苗2′O-甲基转移酶(新英格兰生物实验室)将Cap1结构添加到5’端。通过oligodT亲和纯化纯化mRNA,通过切向流过滤将缓冲液交换到pH5.0的醋酸钠中,无菌过滤,并在-20°C下冷冻,直到进一步使用。

总结:转录采用两步法,需要加帽酶的参与,甲基假尿苷取代尿苷。

3ARCoV-艾博生物

mRNA在体外使用T7RNA聚合酶介导的转录从质粒ABOP-028GENEWIZ)的线性化DNA模板中产生,该质粒编码SARS-CoV-2的密码子优化RBD区域,并包含5’3‘的未翻译区域(UTR)和一条poly-a尾巴,以未修饰的NTP作为原料和T7聚合酶体外进行mRNA的合成,使用了牛痘加帽系统(VacciniaCappingSystem(Novoprotein)进行加帽。

总结:转录采用两步法,需要加帽酶的参与。

(二)mRNA制备过程原料

mRNA制备过程需要用到的主要原料包括质粒DNA模板、一系列酶(主要为7种酶)以及底物核苷酸等;

1、模板DNA所需原料:质粒

DNA模板生产,主要是质粒的生产。编码抗原的DNA模板,通过质粒转染到大肠杆菌大规模体内表达,最后提取和纯化携带目的序列的质粒,即得到DNA模板。目前质粒的生产提取和纯化工艺很成熟,可以自建生产线或者外包出去,例如辉瑞自建质粒生产工厂,大部分mRNA企业外包,Moderna和国内企业目前是外包。

制备mRNA质粒的要求:质粒用于制备mRNA,这类DNA本身不属于APIDNA需要按照GMP规范进行,GMP质粒要求生产设备必须是专用的、符合GMP规范且配备洁净间

2mRNA体外转录所需原料:一系列酶+核苷酸底物

mRNA疫苗的研发与生产需要一系列酶的参与:mRNAT7聚合酶、无机焦磷酸酶、RnaseInhibitor、加帽酶以及2′O-甲基转移酶、Poly(A)聚合酶和DNAase等主要7种酶。

起发生物提供全线mRNA体外转录原料 如下表

产品编号

产品名称

品牌

78MRNA-1001

ATP - Solution (100 mM)

BIOHUB

78MRNA-1002

CTP - Solution (100 mM)

BIOHUB

78MRNA-1003

GTP - Solution (100 mM)

BIOHUB

78MRNA-1004

UTP - Solution (100 mM)

BIOHUB

78MRNA-1005

NTP Bundle  (100 mM)

BIOHUB

78MRNA-1101

N1-Methyl-Pseudo-UTP (100 mM)

BIOHUB

78MRNA-1102

Pseudo-UTP (100 mM)

BIOHUB

78MRNA-1103

RNase Inhibitor - recombinant (40000 U/mL)

BIOHUB

78DA10001

Recombinant RNase Inhibitor(Porcine)(40000 U/mL)

BIOHUB

78MRNA-1104

T7 RNA Polymerase (1 KU/μL)

BIOHUB

78MRNA-1105

Vaccinia Capping Enzyme (10 KU/mL)

BIOHUB

78MRNA-1106

mRNA Cap 2´-O-Methyltransferase (50 U/μL)

BIOHUB

78MRNA-1107

EGFP mRNA (Pseudouridine, Ψ)

BIOHUB

78MRNA-1109

Pyrophosphatase,Inorganic

BIOHUB

78MRNA-1110

Deoxyribonuclease I (DNase I)

BIOHUB

78MRNA-1111

S-adenosylmethionine (SAM)(32mM)

BIOHUB

78MRNA-1112

5-Methyl-CTP (100mM)  

BIOHUB

78MRNA-1113

5-Methoxy-UTP (100mM)

BIOHUB

78MRNA-1114

BsaI (20 U/μL)

BIOHUB

78MRNA-1115

2'OMe-ATP(100mM)

BIOHUB

2.1转录过程所需要的酶

RNA聚合酶体系RNA聚合酶是体外转录mRNA的关键酶。

T3T7SP6RNA聚合酶分别对T3T7SP6噬菌体启动子具有高度的特异性。将目的基因序列克隆到T7SP6启动子下游的多克隆位点中,以克隆的DNA为模板体外合成相应的RNA

T7RNAPolymeraseT7RNA聚合酶)【78MRNA-1104】高度特异识别T7启动子序列,以含有T7启动子序列的单链或双链DNA为模板,以核甘酸(NTP)为底物,合成与启动子下游的单链DNA互补的RNA

无机焦磷酸酶78MRNA-1109加入无机焦磷酸酶,增加RNA产量。无机焦磷酸酶(PPase)可催化无机焦磷酸盐水解生成正磷酸盐,可以为蛋白、RNADNA的生物合成反应提供动力,促进产物的生成。在工业化生产mRNA疫苗的时候会产生大量的无机焦磷酸盐,为了保证mRNA疫苗高效生产,可以添加无机焦磷酸酶,可解除生成的无机焦磷酸盐对反应体系的抑制。

RNase抑制剂【78MRNA-1103/78DA10001】:防止RNA的降解。少量RNaseRNA制备过程中引入,会导致RNA的降解,污染可能通过实验过程中使用的枪头、试管(离心管)和其他试剂引入。通常使用RNase抑制剂作为减少和控制此类污染物的预防措施。

RNase抑制剂能与RNaseA形成1:1复合体,抑制RNase活性,在mRNA疫苗研发和生产过程需要保持mRNA的稳定性以保证疫苗高质量的生产。

2、转录所需材料-核苷酸和修饰核苷酸

mRNA疫苗研发中常进行假尿嘧啶化修饰,尿嘧啶修饰是丰富RNA修饰,一般由尿苷的异构化产生,mRNA的假尿嘧啶化修饰主要有三个功能:改变密码子、增强转录本稳定性和应激反应应答。

3、加帽和加尾:共转录加帽/模板加尾,转录后加帽/加尾

真核生物体内会对转录形成的mRNA进行加帽,即在mRNA5’端添加一个甲基化的鸟苷酸帽子(m7GPPPN结构),从而保护mRNA免遭核酸外切酶的攻击以增加mRNA的稳定性,并且协助mRNA与核糖体的结合以促进翻译起始。生物体内的帽子结构有cap0cap1cap2三种形式,牛痘病毒加帽酶能够在mRNA5’端添加cap0帽子,再使用甲基转移酶处理即可得到cap1帽子。

此外,5'帽子还参加mRNA前体的剪接,参与mRNA3'末端多聚腺苷酸化,保证mRNA在细胞质中的稳定运输。

加帽需要的酶:牛痘病毒加帽酶

可以将7-甲基鸟苷帽结构(m7GpppCap0)加到RNA5末端,大幅提高mRNA的稳定性和启动mRNA的翻译。牛痘病毒加帽酶能够在一小时之内对mRNA进行加帽,效率接近100%

mRNA疫苗研发生产过程中,mRNA加帽效率和加帽mRNA稳定表达的效率对疫苗的工业化生产有重大的影响。牛痘病毒加帽酶体系加帽的mRNA在细胞内的表达效率大于帽子类似物mRNA的表达效率。

加尾酶:Poly(A)聚合酶

Poly(A)聚合酶可以催化ATPAMP的形式依次掺入到RNA3末端,即在RNA3末端加多聚A尾。Poly(A)尾巴能够增强mRNA的稳定性、提高翻译起始效率、引导mRNA出核。

主要用到的酶:

1)牛痘病毒加帽酶【78MRNA-1105】:

2)痘苗2′O-甲基转移酶【78MRNA-1106

3Poly(A)聚合酶

加帽酶非常昂贵,如何替代加帽酶?

一步法合成mRNA疫苗产品的加帽可以在mRNA的体外转录过程中通过掺入帽子序列"实现,这种加帽技术会将加帽序列反向加在mRNA上,在反应体系中加入5’帽类似物,可以省一个加帽酶,以及减少纯化步骤,一定程度上降低成本(尤其是节省了昂贵的加帽酶成本),但相对应地,产量较之两步法(加帽酶参与)减少,因为加帽酶的加帽效率更高。

4、消除DNA模板:需要DNA酶【78MRNA-1110

合成后的产物可能会有DNA残留,在疫苗开发阶段,残留的去除是关键的步骤,以减少下游纯化难度并增加产品的纯度。需要用DNA酶(DNAase将残留的DNA模板进行消除,在mRNA疫苗生产的过程中对DNA的残留控制非常严格格。

三、mRNA高品质

3.1 修饰核苷酸/核苷酸质量标准

依据国际标准进行质量检测和质量控制:

  • 良好品质:产品纯度可达99%以上,且批次间质量稳定;

  • 无动物源成分:合成过程中不引入动物源成分,降低病毒污染风险;

  • 无污染:每批次产品均通过DNA酶、RNA酶及内毒素检测,确保产品合成过程未引入外源无污染;

  • 表达效率保证:产品经过转录测试和表达测试,转录活性和表达活性优于同类产品;

  • 工业级产能:修饰核苷酸产能可满足工业级应用,满足核酸药物从药物开发到工业级生产的不同需求。

    起发Pseudo-UTP纯度 99.2%

 


起发Pseudo-UTP纯度: 99.2%.jpg

Me-Pseudo-UTP纯度纯度99.8%

1-Me-Pseudo-UTP纯度纯度99.8%.jpg

 

3.2 酶质量标准

  • mRNA合成酶系列产品,依据国际标准进行质量检测和质量控制:

  • 良好品质:产品纯度可达95%以上,质控精度优于国产同类产品;

  • 定量检测:采用定量检测方法检测DNA酶、RNA酶残留,精准定量微量残留;

  • 杂质控制:每批次产品均通过DNA酶、RNA酶残留检测,检测精度可达百万分之一酶活单位;

  • 严防污染:生产过程中不引入动物源成分,每批次产品均通过HIVHBVHCV检测;

  • 活性保证:产品经过酶活测试,酶活达到行业标准。

    RNA酶抑制剂纯度100%

     

    637854677626040360720.jpg

     

    牛痘加帽酶纯度99.99%


    牛痘加帽酶纯度99.99%.jpg 

    T7聚合酶酶纯度100%


    T7聚合酶酶纯度100%.jpg

     

    二氧甲基转移酶纯度99.46%

二氧甲基转移酶纯度99.46%.jpg

 

 

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