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疫苗生产中DNA残留检测试剂盒

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产品是用地高辛(地高辛:英文名Digoxigenin,简称DIG;又称异羟基洋地黄毒甙元,是一种类固醇半抗原分子)标记的DNA探针,应用于分子杂交和随后的化学发光检测。检测主要分三阶段进行:1. DNA标记:根据随机引物标记技术,生成DIG地高辛标记的DNA探针。
  疫苗生产中DNA残留检测试剂盒的详细资料:

疫苗DNA残留对人体的潜在危害

对所使用的疫苗,我们zui关心的是疫苗的效果和其安全性。现在很多疫苗是细胞培养疫苗,比如重组(CHO细胞)乙肝疫苗,Vero细胞狂犬病疫苗等大多数疫苗都是用细胞培养的方法生产,而对疫苗的纯化是关键问题,我们要尽可能的去除宿主细胞DNA和宿主蛋白。假若宿主细胞的DNA和蛋白同疫苗一起注入人体将会产生不可预料的后果。就以疫苗DNA残留为例,疫苗DNA残留可能造成插入突变﹑导致抑癌基因失活﹑癌基因被激活等,zui终造成疫苗使用者致癌。

 

疫苗DNA残留的相关法规

由于有如此潜在的危险性,所以许多机构对疫苗DNA残留制定了相关标准,1986年世界卫生组织规定用细胞系生产的疫苗DNA残留不能超过100 pg /支 ,而在1998年世界卫生组织认为细胞系生产的疫苗DNA残留不能超过10 ng /支,而在1997年美国药品食品卫生监督局规定在美国使用的细胞系疫苗DNA残留不能超过10 pg /支,中国规定的细胞系疫苗DNA残留不能超过100 pg /支。

所以在疫苗生产中要随时对DNA残留进行检测,以便知道每个过程除掉DNA残留的能力。在每一批产品中我们必须检测DNA残留,所以我们必须运用敏感且行之有效的对DNA残留定量的检测方法。通常规定每支疫苗DNA残留不能超过100 pg,也就大约等同于17个甚至更少CHO细胞基因组DNA的含量,对如此微量的DNA残留进行检测,所用的技术方法就必须相当敏感和稳定,现在对DNA残留定量的方法主要有以下三种:
1、分子杂交技术检测DNA残留
2、基于DNA结合蛋白的方法(Threshold® immunoassay)检测DNA残留
3、实时定量PCR法检测DNA残留

 

分子杂交技术检测DNA残留的原理和方法

分子杂交分析的基本原理是基于DNA探针检测变性而且固定在纤维素膜上的宿主细胞DNA。这些探针可以不依赖宿主细胞DNA来制备,例如用随机引物制备探针。探针上标记酶﹑生物素﹑放射性同位素﹑地高辛(Dig)等。由于地高辛标记核酸探针,操作方便、灵敏度高,已标记的探针在4℃贮存可达两年之久,方便随时应用,所以现在常采用地高辛标记核酸探针,用光标记法将光敏Dig标记到探针上,制成光敏-Dig-核酸探针,再与固定在膜上的靶核酸进行靶DNA分子杂交,使之与抗Dig-碱性磷酸酶结合,zui后可用不同的检测方式进行检测,发光检测和显色检测均可,灵敏度可达10pg以下(表 1  三种DNA残留检测方法的比较)。

 

基于DNA结合蛋白的方法(Threshold® Immunoassay)检测DNA残留的原理和方法

Threshold® Immunoassay分析系统是基于两种DNA序列非特异性蛋白,单链DNA(ssDNA)结合蛋白(SSB)和抗ssDNA 的单抗。检测的基本过程是当生物素—DNA单链结合蛋白和尿素酶—抗ssDNA 的单抗与变性的宿主细胞DNA结合zui终形成复合物,通过亲合素将此复合物连接到生物素—纤维素膜,在通过洗涤所有非特异性的被洗脱掉,zui后放于有尿素溶液的读数仪,尿素酶催化尿素分解成NH3和CO2 导致PH值发生变化,读数仪根据PH值的变化换算成DNA的量,从而达到检测DNA残留含量的目的。

 

实时定量PCR法检测DNA残留的原理和方法

荧光定量PCR是基于PCR扩增时,在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,产物的增加可以通过荧光信号指示,通过实时监控PCR体系中的荧光信号,对样本中初始模板进行定量分析。定量PCR可实时检测产物量,通过加入已知浓度的标准样品绘制标准曲线,然后根据待测样品在标准曲线中的位置推算初始模板的浓度,从而达到检测DNA残留含量的目的。

 

三种检测DNA残留方法的比较

3种方法用来检测疫苗DNA残留都要对样品进行相应的处理,这对zui终的结果的准确性至关重要。而杂交相对对样品DNA的损失小,而用Q-PCR需要提取样品的DNA,损失较大。在我们选择那种方法时我们要考虑它的稳定性,敏感性,成本等以至找到zui佳的性价比的方法(表 1),从表1 我们不难发现使用分子杂交的方法是一种比较可行经济实用的方法,目前国内也主要是用此方法。

表 1  三种DNA残留检测方法的比较

 

Hybridization

Threshold® Immunoassay

Q-PCR

特异性

物种特异性

无特异性

序列特异性

检测的zui小序列长度(bp)

50

600

150

抗干扰性和稳定性

++

+

+

所需时间(h)

48

6

2

敏感性(pg)

10

6

<1

初期花费($)

1200

>40000

>70000

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